液相色谱串联质谱法同时测定凡纳滨对虾中的27种抗寄生虫药物残留

张丽芳 马瑞欣 郑百芹 宋 旺 周 鑫

(1. 唐山市食品药品综合检验检测中心,河北 唐山 063000;2. 农业农村部农产品品质评价与营养健康重点实验室,河北 唐山 063000;3. 河北省水产技术推广总站,河北 石家庄 050000)

抗寄生虫药物属于兽药,种类众多,且作用机制各不相同,往往根据感染寄生虫的类别或动物种类用药[1-3],但不科学不规范的药物施用方式会带来一些负面作用,如土壤、水文等环境中药物残留的积累和迁移[4-5],寄生虫、微生物等生物体产生耐药性[6-7],药物残留随食物链由食用性动物产品转移到人体[8]等。为此,一些国际组织和国家纷纷制定了食品中兽药残留限量,并不断更新和增补相关内容。中国制定的GB 31650—2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》标准规定了267种(类)兽药在畜禽产品、水产品、蜂产品中的2 191项残留限量及使用要求,依据药物的安全性及其对食品安全的影响程度将兽药(包括部分化学物质)进行了分类,但仍有一些常见的抗寄生虫药物种类不在标准名录之中,需要进一步完善和修订。

目前在抗寄生虫药物残留研究中,较多集中在畜禽等陆地动物源性食品中,且药物种类比较单一,而水产品中抗寄生虫药物残留研究的报道相对较少。研究人员对水产品和环境中的兽药[9-11]、农药(包括抗菌剂)[12]等药物做过相应的监测和评估,而以不同类型的抗寄生虫药物作为药物残留研究对象的报道并不多见,但是抗寄生虫药物作为畜禽养殖常用药物通过环境迁移到水产养殖系统中并在水产动物中富集应予以重视。

由于凡纳滨对虾养殖场很多为非工厂化封闭养殖,养殖过程中可能通过排污、降水等形式受到附近周围畜牧养殖场用药污染和其他形式的药物迁移,出于风险监控和排查的考虑需对凡纳滨对虾进行抗寄生虫药物残留的测定。研究拟选取27种抗寄生虫药物作为凡纳滨对虾的药物监测对象,使用QuEChERS对样品进行提取和净化,超高效液相串联质谱定性定量分析,建立实验室对凡纳滨对虾中抗寄生虫药物残留测定方法,并对市场上销售的凡纳滨对虾进行测定。

1 材料与方法

1.1 试验试剂与耗材

甲醇、乙腈、甲酸:色谱纯,美国Thermo Fisher公司;

甲酸铵:色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司;

氯化钠:分析纯,福晨(天津)化学试剂有限公司;

C18粉、乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine,PSA)粉、中性氧化铝粉(Al2O3):北京迪马科技有限公司;

0.22 μm滤膜:北京迪马科技有限公司;

抗寄生虫药物液态标准品溶液(化合物名称见表1):天津阿尔塔科技有限公司;

表1 化合物离子对信息及其对应质谱参数†

试验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

液相色谱串联质谱仪:Triple Quad 5500+型 (配ESI离子源),美国AB SCIEX公司;

离心机:SORVALL LYNX 4000型,美国Thermo Fisher公司;

电子天平:BT 25 S型,德国Sartorius公司;

氮吹仪:EFAA-DC24-RT型,安谱实验科技股份有限公司;

多位涡旋仪:KN-026S型,北京科德诺思技术有限公司。

1.3 标准溶液配制

吸取适量体积的27种抗寄生虫药物标准品溶液于容量瓶中,甲醇稀释并定容,得到混合标准溶液,-20 ℃保存。

1.4 样品前处理

称取匀浆处理的虾肉样品2 g(精确至0.01 g),先后加入1 g氯化钠和10 mL 80%乙腈水溶液,充分涡旋混合,超声波提取10 min,于4 ℃下6 000 r/min离心5 min,准确吸取上层有机清液2 mL,加入C18和中性Al2O3粉末各100 mg,涡旋1 min充分吸附,取上清液过0.22 μm滤膜,待上机测定。

1.5 基质效应

配制溶剂稀释标准曲线系列梯度和空白基质提取液稀释标准曲线系列梯度,分别进样上机测定并进行线性回归分析,得到溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线,按式(1)计算基质效应(matrix effect,ME)。

(1)

式中:

ME——基质效应数值;

km——基质匹配标准曲线斜率;

k——溶剂标准曲线斜率。

1.6 仪器分析条件

1.6.1 液相色谱条件 色谱柱:Thermo Hypersil Gold aQ (100×2.1 mm, 1.9 μm);柱温:40 ℃;进样量:2 μL;流速:0.4 mL/min。流动相:A,10 mmol/L甲酸铵(含0.1%甲酸)溶液;B,0.1%甲酸—乙腈。采用梯度洗脱:0.0～1.0 min,95% A,1.0～5.0 min,95%～5% A,5.0～8.0 min,5% A,8.0～8.1 min,5%～95% A,8.1～11.0 min,95% A。

1.6.2 质谱条件 离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描模式:正负离子同步扫描模式;监测方式:多反应监测(MRM);喷雾电压(IS):正扫描5 000 V,负扫描-4 000 V;离子源温度550 ℃;气帘气(CUR):172 368.9 Pa;雾化气(GS1):344 737.9 Pa;辅助气(GS2):344 737.9 Pa;碰撞气:7模拟单位。化合物离子对信息和相应其他质谱信息见表1。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

图1 不同母离子选择下多拉菌素的多反应监测响应强度比较

2.2 液相条件优化

2.2.1 色谱柱的选择 选取Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Thermo Hypersil Gold aQ(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)和phenomenex Kinetex F5(100 mm×2.1 mm,2.6 μm)3种长度相同的色谱柱,在相同的条件下对目标化合物的分离情况进行考察。由图2可知,Thermo Hypersil Gold aQ在物质分离程度和峰高的表现优于其他两种,与刘开等[15]在色谱柱上的选择不同,可能是由于化合物种类和数量以及所用的洗脱流动相不同所导致。研究选取Thermo Hypersil Gold aQ色谱柱作为分离用色谱柱,并进行后续试验。

图2 化合物在不同色谱柱上的分离情况

2.2.2 流动相的选择 选取甲醇、乙腈、0.1%甲酸—乙腈作为有机相分别与作为水相流动相的水、0.1%甲酸水溶液、2 mmol/L甲酸铵溶液、2 mmol/L 甲酸铵溶液(含0.1%甲酸)、10 mmol/L甲酸铵溶液、10 mmol/L甲酸铵溶液(含0.1%甲酸)进行组合比较。作为有机相的甲醇和乙腈,乙腈更能够将极性较弱的化合物从色谱柱中洗脱下来,而酸化流动相溶液可以促进咪唑类等药物的离子化程度[16],与此同时,流动相中加入甲酸并未抑制负扫描化合物的离子化,响应信号未见明显的降低。待测化合物中包含有阿维菌素类药物,在母离子选择上选取[M+NH4]+的母离子形式,流动相中加入铵盐可以增强该类物质的离子化水平,并且可以改善色谱峰型。流动相中适宜的酸度和离子强度对于提高检测灵敏度能起到积极作用[14],研究结合多种化合物性质和实际洗脱效果,最终选择0.1%甲酸—乙腈和10 mmol/L 甲酸铵溶液(含0.1%甲酸)分别作为有机相和水相,采用梯度洗脱的形式对化合物进行分离。

2.3 前处理条件优化

2.3.1 提取试剂优化 选取甲醇、乙腈、80%乙腈水溶液、0.2%甲酸—乙腈对虾肉中的抗寄生虫药物进行提取。通过试验回收率对4种提取试剂进行考察,结果见图3。由图3可知,以甲醇作为抗寄生虫药物残留的提取试剂时,虽然其中位值回收率最接近100%,但是各种药物的提取效果呈现出分散的态势,而且回收率大于120%或低于60%的药物较多;以0.2%甲酸—乙腈作为提取试剂,药物的回收率均低于100%,整体回收率过低,并且有9种药物的回收率低于60%;以80%乙腈水溶液作为提取试剂时,各药物回收率比较集中,主要分布在80%～100%。因此,选取80%乙腈水溶液作为提取试剂。

图3 提取试剂对回收率的影响

2.3.2 净化条件优化 C18、GCB(graphitic carbon)、PSA、Al2O3粉等是最常用的吸附剂[4]。PSA可以利用活性基上的氨基去除基质样品中的糖、脂肪酸、有机酸、脂类、极性色素和金属离子,C18对样品中的脂肪和非极性成分具有良好的吸附作用;氧化铝可以吸附脂肪酸等物质。试验比较了C18、PSA和Al2O3粉对提取液的净化效果。通过比较不同的吸附剂、吸附剂用量以及吸附剂的配伍应用,可以得出C18100 mg+Al2O3100 mg联合应用吸附杂质的效果最佳,结果见图4。

图4 吸附剂对药物提取回收率的影响

2.4 基质效应

在应用液相色谱串联质谱特别是配有电喷雾离子源(ESI)对待测物进行分析时,进样液中的杂质可能对分析物产生干扰,产生基质效应,严重影响方法的精密度、准确度,所以要对基质效应进行分析和评估[17]。基质效应消除或补偿的办法很多,常用基质匹配标准溶液校准方法[18]。研究涉及27种抗寄生虫药物在凡纳滨对虾基质中的定性定量分析测定,药物种类较多,且基质中的蛋白、脂肪等杂质容易产生基质抑制或增强效应[19]。由图5可知,马度米星胺和环丙氨嗪显示出基质增强效应,数值达到148.4%和128.8%,而其余25种化合物显示出基质抑制效应,除硝碘酚腈外均小于80%。基质、前处理方法、化合物浓度都是影响基质效应的因素,为了抵消或补偿基质效应带来的影响,采取空白基质标液对线性关系、回收率、精密度等进行考察和实际样品测定。

2.5 线性范围、检出限和定量限

用空白样品提取液对27种抗寄生虫药物标准溶液进行稀释,配制成0.5,1.0,2.0,5.0,10,50,100,200 ng/mL标准曲线系列并上机分析。以质量浓度为横坐标,化合物定量离子峰面积为纵坐标进行线性回归拟合,得到回归方程和相应的皮尔森相关系数r[20]。方法检出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)分别以3倍和10倍信噪比结合前处理过程中的稀释倍数以及称样质量进行计算,结果见表2。

表2 抗寄生虫药物的线性范围、回归方程、相关系数以及检出限和定量限

2.6 回收率和重复性

称取凡纳滨对虾空白样品2 g(精确至0.01 g)并进行标准溶液(1.3)空白基质添加(如表3所示),制备成低、中、高(5,10,50 μg/kg)3个水平的凡纳滨对虾阳性添加样品,每个添加水平进行6次平行试验。阳性添加样品在处理前静置0.5 h,然后按照1.4进行提取、净化,上机分析后计算方法加标回收率和批内变异系数;重复3 d,以计算和分析批间变异系数,见表3。结果表明,方法回收率为61.90%～118.54%,批内变异系数为0.57%～12.56%,批间变异系数为1.29%～16.47%。

表3 凡纳滨对虾在不同添加水平下的回收率和变异系数

2.7 实际样品测定

应用该方法对市场中购买的凡纳滨对虾样品进行抗寄生虫药物残留检测。共测定凡纳滨对虾样品56批,其中1批样品有阿苯达唑检出,1批样品有地克珠利检出,但均未达到该方法的定量限。阿苯达唑和地克珠利的检出,说明已经有抗寄生虫药物渗透、污染到了南美白对虾等水产品养殖环境中并在水产品中存在药物存留的情况,数值虽然未达到该方法的定量限值,但也不应该忽视这一现实问题。这可能不是常规药物施用而导致的药物在饲养动物体内的药物残留问题,可能涉及到了畜产水产养殖、药物迁移、养殖排弃物处置等系列问题,应予以关注。

3 结论

研究建立了液相色谱串联质谱测定凡纳滨对虾中27种抗寄生虫药物的方法,药物经提取、净化后,于色谱柱进行分离,电喷雾离子源正负离子同步扫描,多反应监测模式测定。该方法前处理简单、准确度高、精密度好。试验研究的样品基质为凡纳滨对虾,后续研究将继续扩展虾类品种和药物残留数量,以期适应多样品基质种类和多药物残留的测定要求。