内皮抑制素抑制RhoA/ROCK信号通路减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤实验研究

岳 渊，张 涛，柳朝阳，张鹏霞，肖 漓，张 娟

1 佳木斯大学基础医学院，微生态-免疫调节网络与相关疾病重点实验室，黑龙江佳木斯 154007；2 佳木斯大学第一附属医院神经四科，黑龙江佳木斯 154003；3 解放军总医院第八医学中心呼吸与危重症医学部研究所，北京市器官移植与免疫调节重点实验室，北京 100091

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是指在感染、休克、创伤和烧伤等非心源性疾病过程中，肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质和肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全或呼吸衰竭，是常见的极危重症疾病之一，病死率高达35% ~ 40%[1-4]。RhoA/ROCK通路是钙敏感的信号通路，该通路通过影响肌球蛋白ATP 酶的活性对细胞骨架收缩反应进行调控[5]。ROCK参与多种细胞活动，如增殖、分化、凋亡以及细胞骨架蛋白的合成、降解和运动调控等[6-7]。在细胞骨架收缩反应中，ROCK引起肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC) 的磷酸化，磷酸化的MLC促进肌球蛋白 ATP酶激活，导致细胞骨架蛋白的重组、张力纤维成型和细胞收缩[8]。因此，RhoA/ROCK信号通路在细胞屏障通透性增加中起重要作用，在调节炎症反应中也有明显效果[9]。ROCK有ROCK1和ROCK2两种形态，ROCK1主要在肺中表达[10-11]。内皮抑制素(endostatin，ES)是人基底膜胶原ⅩⅧ水解而来的蛋白质小片段，分子量为20 ~ 28 kU，具有抑制血管内皮细胞增殖与迁移，进而抑制血管生成的功能[12-13]。近年来，对于内皮抑制素的探索主要集中在肿瘤治疗领域，其在急性肺损伤中作用的研究未见报道[14]。本研究拟探讨内皮抑制素在脂多糖诱导的急性肺损伤中的作用及可能机制。

材料与方法

1 实验动物 SPF级C57BL/6小鼠共36只，雄性，6周龄，体质量(20.15 ± 2.29) g，由军事科学院军事医学研究院动物实验中心提供。小鼠饲养于恒定湿温、12 h昼夜循环的SPF级标准动物房内，可自由饮食饮水，适应性喂养1周后再开始实验。实验经军事医学研究院医学伦理委员会批准(编号：IACUC-DWZX-2022-712)，实验动物许可证编号：SCXK(京)2021-0006。

2 主要药物、试剂及仪器 肺部液体定量雾化器(HRH-MAG4)和小动物喉镜(HRH-HAG5)购于北京慧荣和科技有限公司；LPS固体粉末购于美国默克Sigma生物公司(L2880-10MG)；ES注射液(恩度)购于山东先声生物制药有限公司；TUNEL试剂购于瑞士Roche生物公司(11684817910)；含DAPI防荧光淬灭封片剂购于北京中杉金桥有限公司(ZLI9557)；小鼠细胞因子流式试剂Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Inflammation Kit购于美国BD公司(552364)；小鼠VEGF ELISA试剂盒购于深圳欣博盛生物科技有限公司(emc103.96)；兔抗小鼠RhoA多克隆抗体(ab187027)、鼠抗小鼠ROCK1单克隆抗体(ab134181)购于美国Abcam公司；小鼠单克隆抗体β-actin购于Affinity Biosciences生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(p0012s)购于碧云天生物有限公司。酶标仪(M200-PRO，瑞士Tecan)，流式细胞仪(FACSCⅡTM，美国BD公司)，荧光显微镜(Nikon，日本)，电泳仪(DYY-7C)、垂直电泳槽(DYCZ-24DN)与电转仪(DYCZ-40)均购于北京六一仪器厂。

3 动物模型建立及分组 采用随机数法将36只小鼠分为对照组(n=6)、模型LPS组(n=6)和内皮抑制素干预组(LPS＋ES，n=24)，其中内皮抑制素干预组又根据不同的给药剂量和治疗时间分为4组，分别为ES干预组A (LPS + 1 mg/kg ES 6 h，n=6)、ES干预组B (LPS + 1 mg/kg ES 12 h，n=6)、ES干预组C (LPS + 5 mg/kg ES 6 h，n=6)和ES干预组D (LPS + 5 mg/kg ES 12 h，n=6)。将LPS溶液按照15 mg/kg的剂量使用肺部液体定量雾化器对LPS组和内皮抑制素干预组的小鼠进行气管内雾化，造模时间为24 h。内皮抑制素干预组各组在气管内雾化LPS 24 h后，腹腔注射内皮抑制素注射液。如前所述，按照1 mg/kg和5 mg/kg的干预剂量分别作用6 h与12 h。对照组在相同时间点采用同样方式递送等体积0.9%氯化钠注射液。所有实验小鼠均采用过量麻醉法处死(将戊巴比妥钠按照3倍以上常规麻醉剂量对小鼠进行腹腔一次性注射)，留取标本备用。

4 肺组织形态学观察 取出小鼠完整双肺，肉眼观察双肺颜色、光泽、弹性、淤血和肿胀程度，并拍照留存。

5 肺系数检测 取出小鼠完整双肺后，0.9%氯化钠注射液冲洗肺组织表面血渍，用纱布小心吸干表面水分，置于电子秤称取双肺重量并记录，计算肺系数值(%)=肺湿重(g)/体质量(g) × 100%。

6 肺组织病理学检查 新鲜肺组织用4%多聚甲醛固定48 h。经脱水、浸蜡和包埋后用病理切片机4 µm连续切片，HE染色后用显微镜采集图像。用半定量标尺进行评分，双盲法评估肺损伤程度。

7 ELISA检测血清中VEGF含量 取材时，先用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，摘取小鼠单侧眼球取血，静置离心后取上层血清。按照深圳欣博盛生物科技有限公司生产的小鼠VEGF ELISA试剂盒说明书进行操作，实验重复3次。

8 流式细胞术检测TNF-α和IL-6水平 取BALF时，麻醉并固定好小鼠后暴露出气管，在气管分叉处插入气管插管，用预冷的无菌PBS缓慢灌洗小鼠肺部，每次0.7 mL，重复灌洗3次，回收后混匀，立即4℃离心(1 500 r/min，15 min)并取上清。取血方法同上段。流式细胞术检测小鼠血清和BALF中TNF-α、IL-6水平。依据美国BD公司的Cytometric Bead Array Mouse Inflammation Kit说明进行操作，实验重复3次。

9 TUNEL检测肺部细胞凋亡 实验小鼠肺部未经染色的石蜡切片按瑞士Roche生物公司TUNEL试剂盒中的说明书操作，完成后用含DAPI的封片剂封片，荧光显微镜采集图像，采用随机法计数凋亡细胞数，每组切片随机选取1张，每张随机选取10个视野，计数凋亡细胞个数。

10 Western blot检测肺组织RhoA和ROCK1蛋白表达 取少量实验小鼠肺组织样品剪碎匀浆，冰上裂解后4℃离心，BCA法测定蛋白浓度。将制备好的胶固定于电泳槽，蛋白样品及Marker加入上样孔，确定目的蛋白彻底分离时停止电泳。TBST封闭2 h，一抗孵育过夜后，加入二抗，孵育2 h。显影定量分析。

11 统计学分析 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。正态分布的连续变量以表示，计数资料以数值表示。两组间比较采用两独立样本t检验进行分析，多组间比较正态分布的连续变量采用方差分析检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠肺组织形态学观察 经肉眼观察，对照组小鼠肺组织呈淡粉红色且湿润，表面光滑，未出现出血灶和出血点；LPS组小鼠肺组织颜色加深，呈深红色且肿胀明显，局部出现明显出血灶和散在出血点；ES干预组各组随着给药剂量和时间的增加，小鼠肺组织呈现不同程度的变化，肺组织肿胀程度减小，表面颜色变浅。见图1。

图1 各组小鼠肺组织形态学观察Fig.1 Lung morphology observation of mice in each group

2 各组小鼠肺系数结果 与对照组相比，LPS组肺系数增大[(0.64 ± 0.06)%vs(1.15 ± 0.16)%，P＜0.01]；与LPS组相比，ES干预组D肺系数减小[(1.15 ± 0.16)%vs(0.81 ± 0.03)%，P＜0.01]；4个ES干预组之间两两比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见图2。

图2 各组小鼠肺系数结果Fig.2 Lung coefficient of mice in each group

3 各组小鼠肺组织病理学改变 对照组肺泡结构清晰，肺泡间隔未增宽，肺泡腔内无出血且无炎性细胞浸润；LPS组肺泡间隔增宽并伴有大量炎性细胞浸润，肺间质水肿，肺泡结构呈现不同程度的破坏；ES干预组各组肺组织中的炎性细胞浸润和炎性渗出逐渐减少，肺间质增宽程度减小，肺间质水肿程度有所减轻；见图3A。与对照组相比，LPS组肺损伤评分升高(0.29 ± 0.49vs9.9 ±0.69，P＜0.01)；与LPS组相比，ES干预组C、D的肺损伤评分降低(9.9 ± 0.69vs5.9 ± 0.69，P＜0.05；9.9 ± 0.69vs3.4 ± 0.53，P＜0.01)；与ES干预组A相比，ES干预组D肺损伤评分降低(8.71 ± 0.76vs3.4 ± 0.53，P＜0.05)；见图3B。

图3 各组小鼠肺组织病理学检查(A)及肺损伤评分比较结果(B)Fig.3 Lung histopathology (A) and lung injury score (B) of mice in each group

4 各组小鼠肺组织细胞凋亡的改变 与对照组相比，LPS组小鼠肺组织凋亡细胞数增多(0.70 ±0.95vs13.40 ± 5.13，P＜0.01)；与LPS组相比，ES干预组A、B、C、D小鼠肺组织凋亡细胞数均减少(13.40 ± 5.13vs2.30 ± 0.95，P＜0.05；13.40 ±5.13vs2.00 ± 0.82，P＜0.01；13.40 ± 5.13vs2.40 ±1.35，P＜0.05；13.40 ± 5.13vs1.30 ± 1.16，P＜0.01)；4个ES干预组之间两两比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见图4A、图4B。

图4 各组小鼠肺组织细胞凋亡情况 A：各组小鼠肺组织细胞凋亡TUNEL染色；B：各组小鼠肺组织TUNEL染色阳性细胞数Fig.4 Apoptosis of lung tissue cells of mice in each group A: TUNEL staining of apoptotic cells in lung tissue of mice in each group;B: The numbers of TUNEL positive cells in lung tissue of mice in each group

5 各组小鼠血清VEGF水平 与对照组相比，LPS组小鼠血清中VEGF表达上调(32.92 ± 7.85vs219.80 ± 20.77，P＜0.05)；与LPS组相比，ES干预组D血清VEGF表达下调(219.80 ± 20.77vs30.41 ± 6.35，P＜0.01)；4个ES干预组之间两两比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见图5。

图5 各组小鼠血清中VEGF含量Fig.5 VEGF content in serum of mice in each group

6 各组小鼠细胞因子水平 与对照组相比，LPS组小鼠血清TNF-α水平升高 [(3.01 ± 1.78) pg/mLvs(49.71 ± 9.24) pg/mL，P＜0.01]；与LPS组相比，ES干预组D小鼠血清TNF-α水平下降[(49.71 ±9.24) pg/mLvs(6.17 ± 3.81) pg/mL，P＜0.01]；与对照组相比，LPS组小鼠BALF TNF-α水平升高[(10.58 ± 18.33) pg/mLvs(299.70 ± 45.66) pg/mL，P＜0.01]；与LPS组相比，ES干预组各组小鼠BALF TNF-α的水平差异均无统计学意义(P＞0.05)；4组ES干预组的血清与BALF TNF-α的水平两两比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。见图6A。与对照组相比，LPS组小鼠血清IL-6水平升高[(10.72 ±11.65) pg/mLvs(749.90 ± 135.80) pg/mL，P＜0.05]；与LPS组相比，ES干预组B、D小鼠血清IL-6水平降低[(749.90 ± 135.80) pg/mLvs(19.05 ±16.95) pg/mL，P＜0.05；(749.90 ± 135.80) pg/mLvs(10.22 ± 9.00) pg/mL，P＜0.01]；与对照组相比，LPS组小鼠BALF IL-6水平升高[(3.64 ± 6.31) pg/mLvs(161.30 ± 12.16) pg/mL，P＜0.01]；与LPS组相比，ES干预组各组小鼠BALF IL-6的水平差异均无统计学意义(P＞0.05)；4组ES干预组的血清与BALF IL-6的水平两两比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。见图6B。

图6 小鼠血清与BALF中TNF-α (A)和IL-6 (B)的含量Fig.6 Levels of TNF-α (A) and IL-6 (B) in serum and BALF of mice

7 各组小鼠肺组织RhoA和ROCK1的蛋白表达与对照组相比，LPS组小鼠肺组织RhoA和ROCK1蛋白表达增加(0.65 ± 0.06vs1.67 ± 0.46，P＜0.05；0.42 ± 0.03vs1.91 ± 0.74，P＜0.05)；与LPS组相比，ES干预组D小鼠肺组织RhoA和ROCK1蛋白表达下降(1.67 ± 0.46vs0.67 ± 0.15，P＜0.05；1.91 ± 0.74vs0.44 ± 0.03，P＜0.05)；4组ES干预组的RhoA和ROCK1蛋白表达分别两两比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。见图7。

图7 各组小鼠肺组织RhoA和ROCK1表达水平Fig.7 Expression levels of RhoA and ROCK1 in lung tissues of mice in each group

讨 论

一直以来，急性肺损伤都是临床面临的难题，且尚未建立有效防治方法[14]。目前普遍认为急性肺损伤的病理机制与肺部炎症失控有关，以促炎介质增加、炎性细胞浸润、肺毛细血管内皮细胞通透性增高和肺组织细胞凋亡为主要病理特征[15]。因此，控制异常炎症反应可以有效改善预后。LPS是建立急性肺损伤动物模型常用的诱导剂，可激活中性粒细胞，诱导机体产生大量炎性因子，释放炎性介质，触发炎症反应[16]。

肺为高度血管化器官，整个肺血管系统由单层内皮细胞构成，内皮细胞外包裹着富含ⅩⅧ型胶原蛋白的基底膜。内皮抑制素是由ⅩⅧ型胶原蛋白水解而来的蛋白片段，其在人体循环系统中的含量为120 ~ 130 µg/L，在肝、脑、骨骼肌、心、肾等组织提取液中的含量为0.3 ~ 2 mg/L。内皮抑制素可特异性抑制血管内皮细胞生长，主要用于治疗非小细胞肺癌等肿瘤，但其在急性肺损伤中的作用及机制研究未见报道[17-19]。

肉眼观察小鼠肺组织，发现对照组小鼠肺组织呈淡粉红色且表面光滑，未见出血点；LPS组小鼠肺组织肿胀明显，肺表面存在出血灶或出血点，且有液体渗出。肺系数是衡量肺水肿的重要指标，值越高代表肺水肿程度越高。与对照组相比，LPS组肺系数显著升高，表明急性肺损伤小鼠肺水肿严重。HE染色结果显示，对照组小鼠肺组织结构正常，未见明显病理改变，但LPS组小鼠肺间质和肺泡腔内有大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，部分肺泡壁相连间断，呈不规则塌陷状，肺泡间隔充血水肿、明显增宽。与对照组相比，LPS组肺损伤评分显著升高。经不同剂量ES作用不同时间后，小鼠肺组织肿胀程度减轻，肺表面出血点减少或消失，肺组织中炎细胞浸润与炎性渗出减少，肺间质水肿程度减轻，肺泡间隔增厚现象也有明显改善。与LPS组相比，ES干预组D (5 mg/kg，12 h)肺系数值和肺损伤评分均显著降低，证明剂量5 mg/kg的ES干预12 h可显著改善急性肺损伤小鼠的肺水肿和损伤程度。由此初步判断内皮抑制素可以发挥减轻急性肺损伤的作用，验证了研究初期的假设。

细胞因子是炎症反应中的重要炎性介质，在急性肺损伤发病机制中占主导地位，急性肺损伤导致免疫过度激活引发细胞因子风暴[20]。TNF-α和IL-6是细胞因子风暴的关键因子，其在血清和BALF中的水平能反映炎症的严重程度[21]。本研究结果显示，与对照组相比，LPS组血清和BALF中TNF-α、IL-6水平升高；与LPS组相比，ES干预组D血清中该两种因子的水平均下降，提示内皮抑制素可减轻急性肺损伤的炎症反应。ES干预组各组BALF与LPS组相比，TNF-α和IL-6水平降低，但差异无统计学意义。深入分析发现，在小鼠急性肺损伤模型中，内皮抑制素在外周血和肺部区域产生的作用不同，在外周血循环中的作用有显著差异，而肺部区域炎性因子水平变化较小。我们推测与内皮抑制素的作用可及范围有关，本研究递送内皮抑制素的方式为腹腔注射，内皮抑制素经腹膜进入静脉血管，随血液流动发挥作用，一部分到达肺组织后起效缓慢，因此外周血中炎性因子水平降低，而肺部区域差异显著[22-23]。

VEGF是调节血管生成的重要因子，与内皮抑制素相拮抗但又保持动态平衡，主要促进内皮细胞增殖并调节其形态，还能激活多种信号转导途径，参与炎症反应[24]。有研究表明，急性肺损伤发生时，VEGF可作为一种提高肺血管对水和蛋白质渗透性的介质，提高肺内皮细胞屏障的通透性，加重肺水肿[25-26]。本研究发现，与对照组相比，LPS组小鼠血清中VEGF水平显著上升，这与先前的研究结果一致[27]。与LPS组相比，ES干预组D(5 mg/kg，12 h) VEGF水平显著降低，表明内皮抑制素能够拮抗VEGF降低肺血管渗漏的作用，从而缓解急性肺损伤。

细胞凋亡异常引起一系列病理生理变化，凋亡过度时会导致组织细胞坏死和器官功能障碍或衰竭[28]。已明确肺微血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的凋亡是急性肺损伤的发病机制之一，因此抑制肺组织细胞凋亡也是防治急性肺损伤的重要手段[29]。本研究结果显示，与LPS组相比，ES干预组各组小鼠肺组织凋亡细胞数均减少，其中ES干预组B (1 mg/kg，12 h)与ES干预组D(5 mg/kg，12 h)有显著差异。此结果表明内皮抑制素在小鼠急性肺损伤中有一定抗细胞凋亡作用。

研究发现，LPS可激活RhoA/ROCK通路，使RhoA和ROCK1蛋白表达上调，调节细胞骨架收缩，从而增强内皮细胞屏障通透性，使炎性细胞和炎性因子游出，引起炎症反应[30-32]。这与本研究结果基本一致，与对照组相比，LPS组RhoA和ROCK1蛋白表达上调，表明RhoA/ROCK通路激活。本研究首次将RhoA/ROCK信号通路的变化与内皮抑制素对急性肺损伤作用的相关性进行探索。结果表明，与LPS组相比，ES干预组D小鼠肺组织中RhoA和ROCK1蛋白表达下调，提示内皮抑制素通过抑制RhoA/ROCK信号通路阻止内皮细胞屏障通透性增强，干预了炎症级联反应。

本研究将所有结果中ES干预组分别进行两两比较。有研究表明，在脓毒症模型中内皮抑制素干预与生存率存在一定关系，内皮抑制素可呈剂量依赖性地提高脓毒症小鼠的生存率[33]。本实验以此作为理论基础，使用内皮抑制素的剂量分别为1 mg/kg和5 mg/kg。此外，临床上对于急性肺损伤的诊断和治疗通常发生在疾病发作后，因此本研究增加了6 h和12 h两个观测时间点。与ES干预组A (1 mg/kg，6 h)相比，ES干预组D(5 mg/kg，12 h)的肺损伤评分降低，表明随着内皮抑制素给药剂量的加大和作用时间的延长，急性肺损伤得到一定缓解。但在其他结果中，ES干预组之间无统计学差异，我们推测这可能与分组数量有关，本研究所采用的高低两种剂量和两个观测时间点仍存在一定局限性，未能较好地反映出内皮抑制素干预的剂量与时间依赖性。

综上，本研究初步探索了内皮抑制素在急性肺损伤中发挥的积极作用，有望成为治疗急性肺损伤的一种新策略。当然，其中诸多问题仍需深入研究。首先，内皮抑制素的递送方式、给药时间及剂量需要进一步验证；其次，内皮抑制素对急性肺损伤发挥修复作用的机制也仍需探索，RhoA/ROCK信号通路仅是证明其作用的方向之一，其确凿或发挥关键作用的靶点尚未揭示。

致谢感谢解放军总医院第八医学中心呼吸与危重症学部研究所提供的实验平台。

作者贡献岳渊：论文选题，数据收集，数据整理，统计分析，起草文章，论文修改；张涛：论文选题，数据整理，统计分析，论文修改；柳朝阳：数据收集；张鹏霞：数据整理，统计分析；肖漓：论文选题，论文修改；张娟：数据收集。

利益冲突所有作者声明无利益冲突。

数据共享声明本论文相关数据可依据合理理由从作者处获取，Email：yueyuan1110@163.com。