冻融交替对小麦秸秆降解特性的影响

2023-12-27赵子渊艾为党

载人航天 2023年6期

赵子渊，艾为党，卞强，汪震，黄峰

（1.中国航天员科研训练中心人因工程重点实验室，北京 100094；2.中国农业大学土地科学与技术学院，北京 100193）

1 引言

随着深空探测的发展，航天员要在月球等地外基地中生存下去，生存环境实现长期的物质循环供给，离不开受控生态生保系统（Controlled Ecological Life Support System，CELSS）的支持［1］。CELSS 是在有限密闭空间内构建的人-植物-微生物-环境自循环式闭路生态系统，最终实现有限空间内的物质循环利用，在地外空间建立适人居住的类地球环境［2］。从目前受控生态生保系统研究来看，小麦已被选为主要候选物种之一，进行粮食生产，成为航天员的主要食物来源［3-4］。在绿航星际4 人180 天集成试验中，小麦秸秆是产量最多占比最大的固废［5］。麦秆不做处理将严重影响CELSS 中的物质流平衡，降低系统物质闭合度，并造成基地内的环境污染问题。如何处理小麦秸秆，实现密闭系统内物质的回收利用，对建立功能良好的受控生态生保系统意义重大。

目前，生物处理方式如好氧堆肥，可实现小麦秸秆的资源化利用，所得产物既可用作植物栽培基质，也可用于月球土壤的改良，是一种可行的技术途径［6］。然而，由于小麦秸秆中纤维素、半纤维素和木质素等组分交织在一起，形成了紧凑复杂的网状结构［7］，降低了酶的可及性，是阻碍秸秆降解的天然屏障［8］，使得在生物处理过程中，微生物自然发酵周期长、腐熟难度大。研究表明，通过适当的预处理破坏秸秆的复杂结构，打破其抗降解屏障，是实现其生物降解和转化的关键［9］。

冻融交替是一种新兴的秸秆预处理手段，其原理是通过水结晶的反复形成和融化，使秸秆空隙中的游离水结冰后体积膨胀，从而破坏秸秆结构，为后续生物发酵创造有利条件［10］。目前，已有研究人员对此进行了初步探索，李天沛等［11］使用酸、碱、氧化试剂联合低温冻融处理高粱秸秆，-10 ℃冷冻12 h，处理后各组高粱秸秆组分含量与对照组相比均有显著变化，其中木质素去除率最高。Zhang 等［12］在不同冷冻温度和时间下对小麦秸秆进行冻融处理，随着温度的降低和时间的延长，通过扫描电镜观察到秸秆孔径逐渐增大。Li 等［13］以玉米秸秆为原料，在-20 ℃氨水中冷冻12 h，接着20 ℃解冻12 h，持续7 d，秸秆中挥发性固体含量减少了60.6%。由此可见，冻融交替预处理有利于秸秆的后续降解和微生物转化利用。

由于月球温度可降至-180 ℃［14］，航天员可利用天然低温快速节能地完成水的冷冻过程，因此冻融交替法在月球基地中具有极大的应用潜力。然而，目前研究人员大多把冻融作为一种辅助手段，常结合酸、碱等化学处理，在月球基地中并不方便实现；此外，专门针对小麦秸秆的冻融预处理研究较少，关于冻融交替本身对小麦秸秆的降解特性所造成的具体影响尚未明晰。为此，本文，利用超低温冰柜创造低温环境，对小麦秸秆进行冻融交替处理，初步探究冻融交替对其降解特性的影响，以期为冻融交替预处理技术的进一步成熟及其在月球基地中的应用提供参考。

2 方法

2.1 实验材料

小麦秸秆，为实验室自行种植的小麦收获后的残余部分，储存于干燥阴凉处，烘干，剪切至0.3～0.5 cm，基础理化性质见表1。

表1 小麦秸秆基础理化性质Table 1 Basic physicochemical properties of wheat straw

2.2 正交实验设计

设置冷冻温度、冷冻时间和冻融次数3 个因素，并参考前期预实验结果确定出各因素的3 个水平，开展3 因素3 水平正交优化实验，各因素水平设置见表2，另设置CK1组（实验材料为原始秸秆）和CK 组（实验材料用水浸泡8 h，但不进行冻融处理）作为对照组，共计11 个处理组，各处理组重复3 次。

表2 正交因素水平表Table 2 Orthogonal factors and levels

每组取2 g 在60 ℃烘箱中烘干至恒重的小麦秸秆，与40 mL 纯净水混合后置于200 mL 锥形瓶中静置8 h（使水分充分浸入秸秆内部空隙），随后置于超低温冰柜中进行冷冻处理，待超低温冰柜温度降至目标温度时开始计时，达到所设定的冷冻时间后拿出并于25 ℃下解冻，待完全解冻后立即将其放回超低温冰柜中进行下一轮冻融处理，若是最后一轮则使用快速滤纸过滤后将滤液和秸秆置于4 ℃冰箱中储存，秸秆在进行结构检测前烘干。

2.3 测试方法及指标

本文通过可溶性总碳（Total Soluble Carbon，TSC）、可溶性总氮（Total Soluble Nitrogen，TSN）含量来定量研究冻融对秸秆降解特性的影响。一方面，由于可溶性碳、可溶性氮与微生物活性存在紧密联系，是微生物更容易利用的底物［15］，与预处理后的生物处理效果显著相关，可用处理前后其含量的变化来反映冻融效果；另一方面，对所有处理直接进行结构测定难以客观准确地进行定量评价，因此本文首选可溶性总碳及可溶性总氮含量研究冻融对秸秆降解的影响。可溶性总碳浓度使用TOC-VCPH 型总碳分析仪（Shimadzu，日本）测定，并换算为可溶性总碳含量，检测方法参考HJ 501-2009《水质总有机碳的测定燃烧氧化-非分散红外吸收法》［16］；可溶性总氮浓度使用Vario TOC 型TOC／TN 分析仪（Elementar，德国）测定，并换算为含量，检测方法参考ASTM D8083-16（2023）通过高温催化燃烧和化学发光检测在水中计算的总氮和总凯氏定氮（Total Kjeldahl Nitrogen，TKN）的标准测试方法［17］。

通过预处理改变秸秆的微观形貌，有助于增大秸秆比表面积及后续生物处理中酶与底物的接触，通过扫描电镜进行观察验证。将少量制备的小麦秸秆样品烘干后，用碳基胶带粘到扫描电镜载物台上，用S4800 扫描电镜（Hitachi，日本）进行微观形貌观察。测试条件为加速电压15 kV，工作距离为10 mm。

通过X 射线衍射（X-Ray Diffraction，XRD）分析可测定秸秆中纤维素的结晶度，从而判断秸秆降解难易程度的改变。将少量小麦秸秆样品烘干磨碎后，采用D8 advance 型X 射线衍射仪（Bruker，德国）进行小麦秸秆纤维素纤维的晶体结构分析，在2θ＝5°～60°内以2°／min 的扫描速度进行。结晶度CrI（%）计算见式（1）。

式中，Imax为衍射峰强度最大值（约2θ＝22°）；Iam为无定形峰的衍射强度，取2θ＝18.7°的衍射强度值。

傅立叶红外变换光谱（Fourier Trans-form Infrared Spectroscopy，FTIR）分析是一种常见的现代化学分析手段，通过对比小麦秸秆冻融处理前后的谱图，可检测其化学键、官能团的变化，进而了解其结构和组成的改变。采用Nicolet iS10 型傅立叶红外光谱仪（Thermo Scientific，美国）进行分析测定。样品经充分干燥后使用Tissuelyser-24 L 型多样品组织研磨仪研磨过40 目筛，上机测定，分辨率4 cm-1，波数范围400～4000 cm-1。

2.4 数据处理

使用SPSS Statistics 26.0 软件对正交实验结果进行方差分析（ANOVA），P＜0.05 认为差异具有统计学意义。使用Origin 2021 对所得数据进行绘图。

3 结果与讨论

3.1 对可溶性总碳及总氮影响

表3 为不同处理组可溶性总碳分析结果，表4 为可溶性总碳极差R分析结果。通过计算极差R值进行比较，可以看出冻融次数R＞冷冻温度R＞冷冻时间R，三因素中影响最大的是冻融次数，其次是冷冻温度，最后是冷冻时间。分析各因素K值可以看出，随着冷冻温度的降低和冻融次数的增多，可溶性总碳、总氮含量明显升高，而随着冷冻时间的延长，可溶性总碳含量改变不明显。此外，冷冻温度的K3、冷冻时间的K1和冻融次数的K3最高，分别为37.1 mg／g，35.9 mg／g 和38.3 mg／g，得出对应的最优冻融条件为冷冻温度-80 ℃，冷冻时间4 h，冻融次数3 次，即本实验中的处理7，此时可溶性总碳为41.8 mg／g，比仅进行浸泡未进行冻融的CK 对照组高了51.4%。

表3 不同处理组的可溶性总碳Table 3 TSC under different conditions

表5 为可溶性总碳的方差分析结果，由表5结果可知，冻融次数对可溶性总碳含量影响非常显著（P＜0.01），这是由于在每次冷冻过程中，水分结冰膨胀所破坏的秸秆内部空间有限，多次冷冻过程提高了秸秆内部结构被破坏的整体比例；另一方面，秸秆内部相同空间多次受到结冰产生的膨胀力的作用，被破坏得更彻底。冻融次数的显著作用在其他学者的研究中也有体现，Zhu等［18］将杨木切片在-20 ℃下进行冻融处理随后生产半纤维素，随着冻融次数从1 次增加到4 次，半纤维素产率逐渐提高，冻融4 次时半纤维素的产率从64.93 mg／g 提高到85.87 mg／g。

表5 正交实验方差分析-可溶性总碳Table 5 ANOVA analysis on orthogonal tests- TSC

表6 为不同处理组可溶性总氮分析结果，表7 为可溶性总氮极差R分析结果。由表7 可知，3 个因素的影响程度依次为：冷冻温度＞冻融次数＞冷冻时间，与可溶性总碳相比，冷冻温度对可溶性总氮的影响更大，而冻融次数的影响略小。分析各因素3 个水平的K值可以看出，随着冷冻温度的降低和冻融次数的增多，可溶性总氮含量升高，而随着冷冻时间的延长，可溶性总氮含量下降。此外，冷冻温度的K3、冷冻时间的K1和冻融次数的K3最高，分别为9.4 mg／g，9.0 mg／g 和9.3 mg／g，得出对应的最优冻融条件为冷冻温度-80 ℃，冷冻时间4 h，冻融次数3 次，与可溶性总碳的最优条件一致，此时可溶性总氮含量为11.1 mg／g，比仅进行浸泡未进行冻融的CK 对照组高了73.4%。

表6 不同处理组下可溶性总氮Table 6 TSN under different conditions

表7 正交实验极差分析-可溶性总氮Table 7 Range analysis on orthogonal tests-TSN mg／g

表8 为可溶性总氮方差分析结果，由表8 可知，冷冻温度和冻融次数对可溶性总氮影响非常显著（P＜0.01），冻融次数的显著影响与前述可溶性总碳的原因类似。温度的影响主要由冰的物理性质导致，温度越低，冰的硬度越高，对秸秆内部结构的破坏更彻底；此外，温度越低，冰的体积也越大，可破坏的内部空间增大，导致了更多含碳、含氮物质的溶解。

表8 正交实验方差分析-可溶性总氮Table 8 ANOVA analysis on orthogonal tests- TSN

3.2 对小麦秸秆微观形貌的影响

根据3.1 结果，选择可溶性总碳、总氮含量最高的7 组和相对最低的1 组，仅用水浸泡8 h 但不进行冻融处理的秸秆CK 组和原始干秸秆CK1组进行扫描电镜及后续分析。

不同处理下小麦秸秆扫描电镜照片如图1所示，图1（a）可以看出，原始秸秆CK1组结构致密，表面光滑，纹理清晰，几乎无可见孔隙。由图1（b）可知，经水浸泡8 h 后的CK 组表面碎屑物质增多，但整体仍保持致密有序的形态。观察经冻融处理后的图1（c）和图1（d），-40 ℃冻融交替处理1 次的1 组秸秆表面出现少量短而浅的裂纹，而经-80 ℃冻融交替处理3 次的7组秸秆表面出现大量深而密的裂纹。由此可见，冻融对秸秆表面结构有显著的破坏作用，随着冻融条件的加强，秸秆表面的断裂程度越大，比表面积越大，微生物和酶越容易侵入秸秆内部参与其降解。

图1 不同处理下小麦秸秆扫描电镜照片（×650 倍）Fig.1 SEM images of wheat straw under different conditions（×650 times）

3.3 对结晶度的影响

纤维素在小麦秸秆中含量较多，是秸秆中较难降解和转化的部分［19］。纤维素从结构上可划分为结晶区和无定形区，结晶区分子排列整齐，结构致密，较难降解，无定形区分子链无序堆积，相比结晶区更易降解。结晶度即结晶区所占的比例，通过预处理手段降低纤维素结晶度，有利于秸秆后续的生物降解。

不同处理下小麦秸秆XRD 图谱如图2 所示，由图2 可知，所有样品均在2θ为16°和22°左右出现衍射峰，在2θ为18.7°左右出现反向峰，整体呈现典型的纤维素Ⅰ型结构，说明浸泡以及冻融处理对纤维素晶体结构类型无明显影响。此外，经结晶度公式计算，原始秸秆中纤维素结晶度为49.27%，与刘晓英［20］的研究结果相近。1 组和7 组结晶度分别为49.53%和52.21%。可以看出随着冻融条件的加强，纤维素结晶度反而提高。究其原因，是由于冻融同时作用于结晶区和非结晶区［21］，一方面冻融作用破坏了纤维素结晶区的氢键，降低了结晶度；另一方面，根据X 射线衍射图谱计算纤维素结晶度时，半纤维素和木质素被算入无定形区，冻融会使代表无定形区的部分半纤维素溶解［22］。在本文实验结果中，冻融对结晶区的破坏效果小于对无定形区的破坏效果，因此计算得出的结晶度与对照相比反而升高，这与郑续等［23］使用蒸汽爆破法，Kim 等［24］采用氨水，Akhtar 等［25］采用酸、碱辅助微波预处理秸秆后发现纤维素结晶度上升的原因一致。

图2 不同处理下小麦秸秆XRD 图谱Fig.2 XRD pattern of wheat straw under different conditions

3.4 对小麦秸秆化学结构特性的影响

不同处理下小麦秸秆傅立叶红外变换光谱如图3 所示，所有曲线趋势保持一致，没有明显的新特征峰出现，说明浸泡以及冻融处理没有导致新的官能团产生。3350 cm-1处是一个强而宽的-OH 伸缩振动吸收峰，随着处理条件的加强，此吸收峰逐渐减弱，说明秸秆中纤维素之间以及纤维素和半纤维素之间的部分氢键被打断，而氢键是导致纤维素生物降解难度大的一个重要原因［26］，氢键被打断越多，后续的生物降解越容易。2920 cm-1处的吸收峰是由C-H 伸缩振动引起的，在-80 ℃，3 次处理组中此峰明显减弱，意味着冻融处理使纤维素大分子中部分甲基和亚甲基发生了断裂［27］。1730 cm-1处为木质素侧链C ＝O 的伸展振动吸收峰［28］，1510 cm-1处为木质素芳香环中C ＝C 的伸缩振动［29］，这两处吸收峰减弱幅度较小，说明冻融处理对秸秆中木质素的影响不大。波数1047 cm-1处代表纤维素和部分半纤维素中C-O 的伸缩，895 cm-1为纤维素和半纤维素中β-1，4-糖苷键的特征吸收峰［20］，这两峰的变化趋势保持一致。首先，浸泡后的CK 组与原始秸秆CK1组完全重合，说明单纯的水分浸泡无法降解秸秆中的纤维素和半纤维素，而冻融后的2 个处理中这2 个峰强度减弱，意味着冻融处理可以使秸秆中部分纤维素和半纤维素降解；此外，-80 ℃，3 次处理的峰强度比-40 ℃，1 次处理的更低，说明冻融温度越低、次数越多，纤维素、半纤维素降解效果越强，这与前文中可溶性总碳、总氮结果和扫描电镜观察结果保持一致。