依达拉奉对脑梗死大鼠神经髓鞘再生、认知功能及VEGF/Notch1 信号通路的影响

林怀印，孟肖，赵智东

1.衡水市第二人民医院，河北 衡水 053000

2.衡水市中医医院，河北 衡水 053000

脑梗死是指脑局部供血障碍导致的脑组织缺血、缺氧引起的脑组织坏死、软化，从而产生相应脑功能缺损症状的综合征[1]。多数患者是因为脑动脉粥样硬化、血管狭窄或闭塞所致，还可能是身体其它部位血栓脱落，阻塞脑血管所致。脑梗死又称缺血性脑卒中，主要因高血压、动脉瘤、动静脉畸形等原因引起脑血管破裂，形成脑血栓和脑栓塞。其病因包括血管壁病变，心脏病和血流动力学改变，血液成分和血液流变学改变以及脑血管痉挛，受压或外伤等，可引发高血压、心脏病、糖尿病及高血脂症等危险因素，降低认知功能，损伤血管内皮细胞受损，加重机体炎症反应，具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点[2]。神经髓鞘是包裹在神经细胞轴突周围的一层膜，可以防止轴突之间的干扰，增加传导速度，对轴突修复有促进作用[3]。跨膜体受体蛋白（Notch1）信号通路维持神经元，平衡正常生长发育的神经胶质细胞，而血管内皮生长因子（VEGF）促进内皮细胞分裂及血管生长，二者参与中枢神经系统病变，通过调节脑部炎性因子，参与脑缺血缺氧的损伤过程。随着医疗技术的发展进步，对脑卒中的靶向药物研究逐渐丰富，依达拉奉是一种新型自由基清除剂，能捕获新生的高活性自由基，减轻脑缺血引起的脑水肿以及脑组织损伤，目前用于临床治疗脑梗死等颅脑损伤疾病[4]。临床缺乏采用依达拉奉治疗脑梗死髓鞘再生、认知功能及VEGF/Notch1 信号通路的定向研究，故本研究主要讨论不同浓度的依达拉奉，对脑卒中大鼠神经髓鞘再生、认知功能及VEGF/Notch1 信号通路的作用机制，为相关研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50 只SPF 级SD 雄性大鼠，鼠龄4～6 周，体质量（220±20）g，由广西医科大学实验动物中心提供[动物许可证编号SYKG（桂）2018-0005]，大鼠于本院实验动物中心饲养，温度（24±2）℃，湿度50%～80%，12 h 昼夜交替，正常饮食及摄水，该动物实验在河北医科大学动物实验室完成，按照《实验动物管理条例》规定进行实验。动物实验经河北医科大学实验动物伦理委员会批准（伦理批准号2016-0106）。

1.2 药物、主要试剂与仪器

依达拉奉注射液由昆明积大制药有限公司提供，批号2004L00488，规格：5 mL∶10 mg；阿司匹林肠溶片购于拜耳医药保健有限公司，批号BJ16177，规格：100 mg。

戊巴比妥钠（批号57330）购于BIOCAM 公司；苏木素–伊红（HE）染色液（批号20190472）购于湖南金盛徕生物科学有限公司；DAB 试剂盒（货号DA1010）购于北京索莱宝科技有限公司；二抗IgG（货号A21020-1）购于亚科因（武汉）生物技术有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（批号C1319-100）购于北京普利莱基因技术有限公司；；VEGF 一抗（货号K106558P）购于北京索莱宝科技有限公司Notch1 一抗（货号Sfk13818）购于上海士锋生物科技有限公司。

DYCZ-24DN 垂直电泳槽、DYCZ-40 电泳仪均购于中国北京六一仪器厂；TDZ4-WS 低速离心机购于上海卢湘仪离心机仪器有限公司；RT-6100 酶标分析仪购于Rayto 公司；BX53 光学显微镜购于上海通灏光电科技有限公司；UNION-A 免疫分析仪购于深圳市亚辉龙生物科技有限公司。

1.3 大鼠分组及动物模型建立

对参与实验的大鼠常规饲养，设立对照组、模型组、阿司匹林组和依达拉奉1.5、3 mg/kg 组，每组10 只。除对照组外，其余大鼠均建立大脑中动脉梗死模型[5]。用40 mg/kg 剂量2%戊巴比妥钠对大鼠进行ip 麻醉后，将大鼠固定于动物手术台消毒，确保术区的无菌状态，于颈部皮肤行正中纵向切口，暴露并钝性分离左侧颈总动脉，用动脉夹暂夹闭。颈外动脉远端结扎并切断，颈外动脉残端系丝线以阻止血液流出，而后松开夹闭颈总动脉的动脉夹。线栓由颈外动脉残端插入颈内动脉，插入距颈总动脉分叉约18 mm 处，遇阻力则停止插入。大鼠向对侧转弯、同侧眼裂减小和对侧肢体瘫痪，提示脑卒中大鼠模型复制成功。造模期间动物膝关节无破损症状，动物无死亡，实验数据完整无脱落。

1.4 给药方法[6]

建模成功后，将依达拉奉注射液用生理盐水稀释成0.5 mg/mL 浓度备用，依达拉奉1.5、3 mg/kg组大鼠分别尾iv 1.5、3 mg/kg 依达拉奉注射液，2次/d，连续7 d。阿司匹林组将阿司匹林以生理盐水配成10 mg/mL 混悬液，造模后第7 天注射4 mg/kg的阿司匹林溶液，给药1 次，其余大鼠尾iv 等量（约2 mL）的生理盐水。

1.5 穿梭箱联合水迷宫实验观察大鼠认知功能

在穿梭箱的顶部装置蜂鸣报警器，在底部在穿梭箱的铺一层电栅。用食物将大鼠引导至穿梭箱内部的任一侧10 s 后，打开蜂鸣报警，待警报铃声响5 s 后，经过穿梭箱底部的电栅给电刺激大鼠，大鼠逃到箱内另一侧时，蜂呜自动停止。观察大鼠蜂鸣期间主动逃避次数以及被电次数，1 次/d，10 个循环/次。

设置水深52 cm、水温25 ℃的水迷宫，安全岛高度低于液面，设置成50 cm。记录各组大鼠游到安全岛的时间，在第20 天时统计训练所用的时间结果，比较学习潜伏期及记忆潜伏期所用时间，时间越长表明认知功能损伤越重。

1.6 ELISA 法检测各组大鼠血清髓鞘碱性蛋白（MBP）含量

大鼠尾静脉采血1 mL，收集血清备用。待血液凝固离心5 min 后，取塑料EP 管，将凝固血液倒入管中封口，于-20 ℃冰箱保存。按照试剂盒说明书操作。

1.7 Pal-Weigert 染色观察大鼠神经髓鞘形态

麻醉大鼠，切开胸膛暴露心脏，从心尖插入灌注针至主动脉，灌注100 mL、4 ℃的4%多聚甲醛。然后对大鼠开颅取脑，参照大鼠脑立体定位图谱，切取大鼠内囊前囟尾侧大约2.5 mm 的脑组织，放入4 ℃的4%多聚甲醛进行固定，12 h 后将脑组织经蔗糖脱水，切片机切取厚冠状切片（厚30 mm），重铬酸钾水溶液预染3 d，0.5%的铬酸中放置1 h，蒸馏水再次漂洗后，放入染液（用10%苏木素醇10 mL＋冰醋酸1 mL＋蒸馏水100 mmL 混匀调配）6 h 进行染色，用4%的高锰酸钾水溶液分色30 s，看见清晰的灰白质后再放入0.01 mol/L 的PBS 中，再用脱色液（1%草酸＋1%亚硫酸钾混匀调配）分色5 min 至白质清晰可见，用饱和碳酸锂1 mL＋500 mL蒸馏水返蓝，正常神经髓鞘呈深蓝色，于0.01 mol/L PBS 中漂洗20 min 后，用2%伊红水溶液复染5 min，乙醇脱水3 min 后，光镜下观察Pal-Weigert 髓鞘染色。

1.8 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色测定各组大鼠脑梗死体积

大鼠于给药后12 h 做深度麻醉，0.9%氯化钠注射液200 mL 心脏灌注后，断头取脑，-20 ℃快速冷冻15 min，由前向后每隔2 mm 冠状行脑组织切片，将脑片置于2% TTC 生理盐水溶液中（对照组织染成红色，模型组织苍白），37 ℃避光孵育30 min，期间每隔8 min 翻动1 次，显色完毕后10%福尔马林固定3～5 h，数码相机拍照。用Image-Pm Plus6.0图像分析系统计算脑梗死体积。

1.9 免疫印迹法检测各组大鼠VEGF/Notch1 水平

将组织样品剪切为细小碎片，加入裂解液，于12 000 r/min 离心10 min，留取上清液，收集蛋白，采用Bradford 法检测。每100 μL 的蛋白混合等体积5×上样缓冲液，100 浴箱中100 ℃加热5 min，待变性发生后，进行10% SDS-PAGE 凝胶电泳，通过转膜、封闭及洗膜后加一抗VEGF（1∶500）、Notch1（1∶500），4 ℃孵育过夜，过氧化物酶抗兔IgG 二抗（1∶2 500），2 h 封闭完成后加入洗涤液进行洗涤，10 min/次，重复3 次。用DAB 显色试剂盒在X 胶片感光、显影、定影完成后在暗室中完成显色。以GAPDH 蛋白为内参，IPP 6.0 软件检测蛋白电泳带灰度值与GAPDH 条带灰度值比值，比较对比值。

1.10 统计学分析

采用GraphPadPrism 软件进行分析，所有数据符合正态分布，采用表示，组间采用独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠认知功能比较

与对照组比较，模型组主动逃避次数减少，被电次数、学习和记忆潜伏时间增加（P＜0.05）；与模型组比较，依达拉奉1.5、3 mg/kg 组主动逃避次数增加，被电次数、学习和记忆潜伏时间减少（P＜0.05），且呈剂量相关性，见表1。

表1 各组大鼠认知功能比较（，n=10）Table 1 Comparison of cognitive function in each group (,n=10)

表1 各组大鼠认知功能比较（，n=10）Table 1 Comparison of cognitive function in each group (,n=10)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05；与依达拉奉1.5 mg·kg-1 组比较：&P＜0.05*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs model group;&P＜0.05 vs edaravone 1.5 mg·kg-1 group

2.2 各组大鼠血清MBP 含量比较

与对照组比较，模型组血清MBP 含量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，依达拉奉1.5、3 mg/kg组血清MBP 含量均显著下降（P＜0.05），且呈剂量相关性，见图1。

图1 各组大鼠血清MBP 水平比较（，n=10）Fig.1 Comparison of serum MBP levels in each group(,n=10)

2.3 各组大鼠神经髓鞘形态比较

对照组内囊神经纤维髓鞘染成深蓝色，且着色清晰，背景为极浅的淡黄色；模型组髓鞘崩解、破坏、脱失严重，髓鞘稀疏，部分区域有髓鞘断裂缺失，染色变浅；依达拉奉1.5、3 mg/kg 组及阿司匹林组内囊的髓鞘脱失明显减少，髓鞘分布较致密，染色较深，且以依达拉奉3 mg/kg 组尤其明显，见图2。

图2 各组大鼠神经髓鞘形态比较（×200）Fig.2 Comparison of nerve myelin morphology of rats in each group (×200)

2.4 各组大鼠脑梗死体积比较

与对照组比较，模型组梗死体积升高（P＜0.05），与模型组比较，依达拉奉1.5、3 mg/kg 组梗死体积均显著下降（P＜0.05），见表2、图3。

图3 各组大鼠脑梗死体积比较Fig.3 Comparison of cerebral infarction volume in each group

表2 各组大鼠脑梗死体积比较（，n=10）Table 2 Comparison of cerebral infarction volume of rats in each group (,n=10)

表2 各组大鼠脑梗死体积比较（，n=10）Table 2 Comparison of cerebral infarction volume of rats in each group (,n=10)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05；与依达拉奉1.5 mg·kg-1组比较：&P＜0.05*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs model group;&P＜0.05 vs edaravone 1.5 mg·kg-1 group

2.5 各组大鼠VEGF/Notch1 水平比较

与对照组比较，模型组VEGF 水平下降，Notch1水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，依达拉奉1.5、3 mg/kg 组VEGF 水平升高，Notch1 水平下降（P＜0.05），见表3、图4。

图4 各组大鼠VEGF/Notch1 水平Fig.4 VEGF/Notch1 levels in each group

表3 各组大鼠VEGF/Notch1 水平比较（，n=10）Table 3 Comparison of VEGF/Notch1 levels in each group(,n=10)

表3 各组大鼠VEGF/Notch1 水平比较（，n=10）Table 3 Comparison of VEGF/Notch1 levels in each group(,n=10)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05；与依达拉奉1.5 mg·kg-1组比较：&P＜0.05*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs model group;&P＜0.05 vs edaravone 1.5 mg·kg-1 group

3 讨论

我国属于脑梗死高发病率国家，有较高的致残率和致死率，对人类健康产生威胁，降低人类生活质量[7]。临床对脑梗死的治疗多从抑制神经元凋亡、清除自由基及降低神经炎症反应等进行溶栓，但因大部分患者去医院就诊的时效性影响，致使疗效不明显[8]。依达拉奉作为一种神经保护剂在脑梗死治疗中开始广泛，本研究发现依达拉奉调控Notch 信号通路促使血管新生，改善脑认知功能。

本研究结果显示，通过水迷宫联合穿梭箱实验，与模型组比较，依达拉奉干预后，大鼠主动逃避次数增加，被电次数、学习和记忆潜伏时间减少，说明依达拉奉治疗组大鼠的学习、记忆、行为能力提升，改善认知功能。当患者发生脑出血时，依达拉奉发挥清除氧自由基的生物活性，控制脂质过氧化的产生，对神经细胞及内皮细胞产生的氧化作用进行有效抑制，降低发生脑水肿发生几率，保护神经系统及神经元结构。有研究证实，当对机体静脉注射依达拉奉时，大部分药物都会通过血脑屏障发挥作用，降低钙离子、镁离子水平紊乱水平，恢复脑组织正常供血，抑制神经炎性反应，从多方面改善神经认知功能[9]。对血管性痴呆大鼠进行迷宫、穿梭箱实验研究发现，依达拉奉组大鼠电击次数明显减少，动逃避次数增加，说明依达拉奉组大鼠能改善血管性痴呆大鼠包括记忆、学习和行为方面的认知能力，发挥对大鼠的脑保护作用[10]。有研究表明，通过定位航行及空间探索的水迷宫实验，依达拉奉组大鼠逃避潜伏期明显缩短，在原平台象限内的游泳时间明显延长，穿环数明显增多，说明经依达拉奉干预后，可部分改善由于长期、反复的慢性痫性发作引起的认知功能减退，学习记忆能力下降情况，减少认知功能障碍[11]。

本研究结果显示，与模型组相比，依达拉奉各剂量组血清MBP 含量显著逐渐降低，对神经髓鞘Pal-Weigert 染色后发现，对照组内囊神经纤维髓鞘染成深蓝色，且着色清晰，模型组染色变浅，存在髓鞘稀疏有缺失情况，经药物干预后，髓鞘脱失缓解，染色加深，以依达拉奉3 mg/kg 组更为明显，说明经依达拉奉可调控MBP 蛋白含量，改善神经髓鞘形态。正常生理下的髓鞘结构紧凑，对有髓神经纤维起到高膜阻抗和低电容作用，有利于跳跃式神经冲动传导的正常发生。MBP 属于强碱性膜蛋白中的神经髓鞘所特有的、重要的脂蛋白，主要由少突胶质细胞分泌[12]。在正常情况下MBP 蛋白在血液中的含量非常少，脑卒中时，脑组织缺氧，少突胶质细胞开始凋亡，MBP 脱落于脑脊液并从血脑屏障漏到血液，使得血清MBP 蛋白水平异常升高。有研究显示，缺血性脑卒中的发生，会造成脑组织缺血损伤和出现过量氧自由基，髓鞘脱失，MBP 穿过血脑屏障于脑脊液中大量释放，升高血清MBP 水平，说明未经治疗的大鼠在脑缺血早期髓鞘和血脑屏障破坏严重[13]。依达拉奉具有捕获自由基的优势，调控机体内黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤氧化酶活性，对缺血再灌注损伤中产生自由基进行有效清除，抑制神经细胞过氧化，降低神经细胞的死亡率，减轻机体因脑缺血或脑缺血引起的脑水肿及神经细胞损伤。脑的缺血缺氧性损伤通过依达拉奉干预，使位于前脑室下区的神经干细胞激活，出现少突胶质祖细胞，再迁移到内囊区分化为成熟的少突胶质细胞，调控MBP 蛋白含量，促进髓鞘再生，减轻脑损害。相关研究表明，依达拉奉在脑梗死的治疗中，通过调节花生四烯酸代谢水平，实现抑制脑缺血所致的脑水肿及大脑皮质水肿的目的，清除自由基，降低MBP 含量，实现维持中枢神经系统髓鞘结构和功能的稳定[14]。研究发现，依达拉奉联合相关神经因子联合治疗脑出血，能有效清除氧自由基，降低MBP 蛋白水平，改善神经功能缺损[15]。

Notch 信号通路维持神经元和神经胶质细胞的正常生长发育，调节微血管形成，在γ-分泌酶作用下激活，裂解释放出Notch1 受体胞内活性片段（NICD），可不经其他信号转导分子的作用而直接进入细胞核，与转录因子或其他调节子结合，从而调节各种细胞活动。VEGF 是近年来发现的生长因子，具有促内皮细胞分裂的作用，正常情况下VEGF并不在脑内表达,多数血管新生处于静息状态，在梗死发生后，VEGF 开始大量合成分泌，促进内皮细胞的分裂和血管生长，建立起梗死后的侧支循环结构。本文研究结果显示，与模型组相比，依达拉奉组VEGF 升高，Notch1 水平下降，脑梗死体积减少，并有浓度有相关性，说明依达拉奉可通过下调Notch 信号通路，促进VEGF 活性，改善脑梗死体积。依达拉奉利用分子量小、脂溶性高的特点，可快速穿透血脑屏障进行氧自由基的清除，保护细胞膜免受损伤，对小胶质细胞的活化进行抑制，减少炎症介质释放，实现治疗缺血性脑损伤的作用，缩小脑梗死后半暗带范围，减少梗死体积，改善血管修复功能[16]。动物实验证实，依达拉奉对VEGF 的生物活性进行促进，通过分泌VEGF抑制神经炎症，修复血管功能，发挥脑保护作用[17]。相关研究表明，经依达拉奉干预后，慢性脑缺血大鼠VEGF 活性升高，抑制炎症反应，降低白细胞介素（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，提高血管修复的功能，发挥脑保护作用[18]。研究显示，Notch 通路的激活会促进活化小胶质细胞，导致炎性介质浸润组织，损伤神经元，在脑缺血发生早期对Notch 通路进行抑制，可大大降低炎症损伤，有利于组织的修复[19]。有研究表明，依达拉奉干预后，通过抑制Notch 信号通路表达，影响小胶质细胞的激活，调控核因子-κB（NF-κB）介导，减少炎性因子的产生，进而引起Notch1 信号通路下游NICD 水平下调，减轻激活小胶质细胞介导的炎性反应，减轻神经损伤[20]。有研究发现，依达拉奉治疗缺血性脑损伤大鼠，其机制可能是通过抑制Notch 信号通路的表达，降低小胶质细胞的活化性，减少Notch1、NICD、转录因子（Hes-1）及小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白（Iba1）水平，从而降低白细胞介素（IL-6）、IL-1β、TNF-α 水平，减少炎症因子释放，改善神经损伤[21]。

综上所述，依达拉奉可促进VEGF 活性，抑制炎症反应，调控Notch1 信号通路，影响小胶质细胞的激活，降低MBP 蛋白表达，促进神经髓鞘再生，提升认知功能。

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