酶解制备蚕蛹免疫肽条件优化

李庆荣 陈敏仪 邢东旭 肖 阳 张伟龙 杨 琼

酶解制备蚕蛹免疫肽条件优化

李庆荣 陈敏仪 邢东旭 肖 阳 张伟龙 杨 琼

（广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 广东广州 510610）

蚕蛹蛋白是一种优质的蛋白质资源，在畜禽及水产养殖中备受关注。文章以新鲜蚕蛹为原料，以抑菌活性为目标，采用酶解法制备具有较好抑菌活性的酶解产物，并通过单因素试验的方法优化酶解工艺条件。结果显示：在pH=3.0、酸性蛋白酶量6 000 U/g、酶解温度43 ℃、酶解时间4 h的工艺条件下，得到的酶解液抑菌活性较强。期望研究结果为蚕蛹蛋白源生物活性肽的制备提供一定的理论基础，并为其在淡水养殖饲料中的应用提供参考。

蚕蛹；酶解；免疫肽

随着渔业的迅速发展与扩张，水产养殖业进入了高密度、高产量的精养模式，水产养殖病害日益严重。抗生素等鱼药在水产养殖与疾病控制中起着不可替代的作用。然而，由于鱼药大多是仿制兽药、人用药和农药等，存在科学性不足、针对性不强、药效不高、对环境影响大等问题。根据《中华人民共和国农业农村部公告 第194号》，饲料用抗生素自2020年7月1日起全面退出市场，为保障畜禽水产养殖的生产效益和食品安全，开发安全、高效的抗生素替代品成为养殖业健康发展的难点和热点[1-2]。

我国蚕桑资源丰富，桑园种植面积超过1 300万亩，蚕蛹年产量达30万t以上。蚕蛹中蛋白质含量较高，占其干物质重的45%～50%，蚕蛹蛋白是一种比大豆蛋白更具营养价值的优质蛋白质资源。近几年，蚕蛹蛋白在鳊鱼、草鱼、鸭嘴鱼、南美白对虾、罗氏沼虾等水产养殖上的应用研究表明，其能明显降低饲料成本，提高生长速度，降低饵料系数等[3-5]。

蚕蛹不仅是优质蛋白原料来源，还富含黄酮、抗菌肽、诱食肽等功能性活性物质，是一种优质的功能性饲料原料。蚕蛹作为一种蛋白源添加进鱼类饲料中，广泛应用于水产养殖，将在水产养殖与饲料优化方面的发展中起到重要作用[6]。酶解和发酵处理是常用的制备蚕蛹蛋白活性肽和改善饲料用蚕蛹原料品质的方法。Rangacharyulu等发现蚕蛹经特殊微生物发酵后作为鱼饲料进行投喂，能够显著提高鱼苗的成活率和产量[7]，这为淡水养殖鱼类疾病提供了新的治疗方案。酶解是一种以蛋白质为底物，在酶的催化下，大分子蛋白质经过水解反应转化为小分子的肽或氨基酸的过程，条件温和，安全且价格低廉，原料易取[8]。有研究表明，蚕蛹粉经酶解后大分子蛋白降解为小分子多肽，这些肽可能具有抗氧化、增强免疫力、促生长和抗肿瘤等多种功能[9-10]。由于不同蛋白酶的酶解产物不同，蚕蛹蛋白的酶解液功能也有很大差异。因此，为了获取一种能够提高淡水鱼类免疫力的蚕蛹免疫肽的制备方法，本文以新鲜蚕蛹为原料，以提高酶解液对水产病原菌的抑菌活性为目标，筛选合适的蛋白酶并优化了该蛋白酶的酶解工艺参数。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜蚕蛹由广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所提供。所用水产病原菌包括嗜水气单胞菌（）、荧光假单胞菌（）和哈维氏弧菌（），皆为广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所蚕桑南药与微生物资源加工利用研究室保存。酶解选用的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶，为上海源叶生物科技有限公司生产。脑心浸出液肉汤（BHI）培养基为环凯生物科技有限公司生产。抗生素对照选取庆大霉素，为北京索莱宝科技有限公司生产。

1.2 不同蛋白酶酶解液制备

称量一定质量的新鲜蚕蛹，与水混合（蚕蛹与水的质量比为1∶1），由匀浆机进行匀浆处理。选用不同的蛋白酶作为候选酶解酶，按表1的酶解条件进行酶解，收集酶解液，煮沸5 min灭活后，灭活的酶解液通过75 μm孔径滤布过滤，收集滤液用于抑菌圈试验。

表1 不同蛋白酶酶解条件

1.3 平板抑菌法

采用平板打孔法测定酶解液的抑菌效果。首先，配制LB培养基（培养基配方见表2，若配制液体培养基则不加琼脂）和BHI培养基，按1%的接种比例接种嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌到LB液体培养基中，接种哈维氏弧菌到BHI液体培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养过夜。然后，分别在LB固体培养基及BHI固体培养基中加入培养好的嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌及哈维氏弧菌（菌株终浓度约为1×106CFU/mL～5×106CFU/mL），摇匀，倒入培养皿，凝固后用打孔器打孔。最后，用制得的酶解液在孔中点样，点样量均为60 μL，培养基中间加入庆大霉素作为阳性对照，待吸收干燥后，30 ℃倒置培养过夜，观察抑菌圈。

图1 不同蛋白酶酶解液的抑菌效果

图中A、B、C分别为含哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌的平板；1、2、3、4分别为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶酶解液；箭头所指为酸性蛋白酶酶解液对所检病原菌的抑菌圈，短线所示为抑菌圈半径大小；中间为抗生素对照。

表2 LB固体培养基配比

1.4 酸性蛋白酶酶解条件优化

根据不同蛋白酶酶解液抑菌圈试验的结果（具体见2.1节），选择酸性蛋白酶为本试验的目标蛋白酶，进一步对酸性蛋白酶酶解蚕蛹浆液的条件进行优化。按照1.2节的试验方法对蚕蛹进行匀浆，而后在其他条件一定的情况下，分别改变pH（3.0、4.0、5.0和6.0）、酶解温度（37 ℃、40 ℃、43 ℃、46 ℃）、酸性蛋白酶量（4 000 U/g、5 000 U/g、6 000 U/g、7 000 U/g和8 000 U/g）、酶解时间（1 h、2 h、3 h、4 h和5 h）进行酶解，以抑菌活性为目标，针对嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌进行抑菌圈试验。

2 试验结果

2.1 不同蛋白酶酶解液抑菌效果比较

将用不同蛋白酶制备的酶解液滤液用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，采用平板抑菌法进行抑菌圈试验，结果见图1。可见酶解4 h后，酸性蛋白酶酶解液对所测病原菌都有显著的抑菌效果，而其他3种蛋白酶酶解液则没有明显的抑菌圈，如图1所示，箭头所指为酸性蛋白酶酶解液的抑菌圈。基于本部分的结果，在后续试验中选择酸性蛋白酶作为蚕蛹浆液的酶解酶。

2.2 不同酶解条件下酸性蛋白酶酶解液抑菌效果分析

2.2.1 不同pH

分别调节蚕蛹匀浆的pH为3.0、4.0、5.0、6.0，加入酶用量为6 000 U/g的酸性蛋白酶，在43 ℃下酶解4 h后，100 ℃煮沸使酶失活，用75 μm孔径滤布过滤得到滤液，进行抑菌圈试验。试验结果如图2所示，可以看出，在pH=3.0条件下酶解的蚕蛹酶解液对2种细菌（嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌）的抑菌效果最好，其次是pH=4.0，而在pH=5.0和pH=6.0下酶解液没有抑菌效果。

图2 不同pH条件下酸性蛋白酶酶解液的抑菌效果

A为嗜水气单胞菌平板，B为荧光假单胞菌平板。1、2、3、4分别代表酶解pH为3.0、4.0、5.0、6.0，中间为抗生素对照。

2.2.2 不同酶解温度

调节蚕蛹匀浆的pH为3.0，加入酶用量为6 000 U/g的酸性蛋白酶，分别在37 ℃、40 ℃、43 ℃、46 ℃下酶解4 h后，100 ℃煮沸使酶失活，用75 μm孔径滤布过滤得到滤液，进行抑菌圈试验。试验结果如图3所示，可以看出，在37 ℃下酶解的蚕蛹酶解液对2种细菌（嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌）的抑菌效果最差，在43 ℃下酶解的蚕蛹酶解液对2种细菌的抑菌效果最好。

图3 不同酶解温度下酸性蛋白酶酶解液的抑菌效果

A为嗜水气单胞菌平板，B为荧光假单胞菌平板。1、2、3、4分别代表酶解温度为37 ℃、40 ℃、43 ℃、46 ℃；A中间为抗生素对照，B中间为无菌水对照（排除假阳性的可能）。

2.2.3 不同酶量

调节蚕蛹匀浆的pH为3.0，加入酸性蛋白酶的用量分别为4 000 U/g、5 000 U/g、6 000 U/g、7 000 U/g、8 000 U/g，在43 ℃下酶解4 h后，100 ℃煮沸使酶失活，用75 μm孔径滤布过滤得到滤液，进行抑菌圈试验。试验结果如图4所示，可以看出，在6 000 U/g、7 000 U/g、8 000 U/g酶量下酶解的蚕蛹酶解液对2种细菌（嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌）的抑菌效果比在4 000 U/g和5 000 U/g下更好。

图4 不同酶量条件下酸性蛋白酶酶解液的抑菌效果

A为嗜水气单胞菌平板，B为荧光假单胞菌平板。1、2、3、4、5分别代表酶解的酶量为4 000 U/g、5 000 U/g、6 000 U/g、7 000 U/g、8 000 U/g；中间为抗生素对照。

2.2.4 不同酶解时间

调节蚕蛹匀浆的pH为3.0，加入酶用量为6 000 U/g的酸性蛋白酶，在43 ℃下分别酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后，100 ℃煮沸使酶失活，用75 μm孔径滤布过滤得到滤液，进行抑菌圈试验。试验结果如图5所示，可以看出，不同酶解时间的蚕蛹酶解液对2种细菌（嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌）的抑菌效果差别不大。

图5 不同酶解时间下酸性蛋白酶酶解液的抑菌效果

A为嗜水气单胞菌平板，B为荧光假单胞菌平板。1、2、3、4、5分别代表酶解时间为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h；A中间为抗生素对照，B中间为无菌水对照（排除假阳性的可能）。

3 分析与讨论

蚕蛹作为一种饲料用蛋白源在水产养殖中应用广泛，在水产养殖与饲料配方优化中起到重要作用。大分子蛋白经蛋白酶酶解后变成小分子多肽，利于动物的消化与吸收，更提高了抗菌、免疫及抗氧化等活性。根据蛋白酶的作用机理，不同蛋白酶因为作用位点的差异，酶解产物不同，蚕蛹蛋白的酶解液功能也有很大差异。

本文通过对蚕蛹进行不同蛋白酶酶解，筛选出适宜的酶解酶为酸性蛋白酶，而其他几种候选蛋白酶的酶解产物对目标病原菌无显著的抑制效果。这可能是因为不同蛋白酶的作用位点差异导致酶解产物不同，小分子的肽段活性也有所不同。利用单因素试验，获得了酶解后抑菌活性显著增强的酶解工艺：pH=3.0、酶解温度43 ℃、酶量6 000 U/g、酶解时间4 h。在其他条件下，比如酶解温度46 ℃、酶量7 000 U/g～8 000 U/g、酶解时间5 h等，获得的酶解液也有较好的抑菌效果，但考虑到生产上的成本控制及酶解效率等，优先选择上述酶解工艺。本研究明确了制备针对哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌及荧光假单胞菌等水产病原菌具有高抑菌活性的蚕蛹免疫肽的工艺，为蚕蛹在健康养殖中的高值化利用提供参考。

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S886.9

A

2095-1205(2023)11-01-04

10.3969/j.issn.2095-1205.2023.11.01

佛山市财政专项资金2022年度高水平广东省农业科技示范市建设项目“多功能蚕蛹蛋白增强淡水养殖鱼类免疫力的研究及其应用”

李庆荣（1977—），女，汉族，山东潍坊人，博士研究生，副研究员，研究方向为蚕桑资源综合利用。

杨琼（1970—），女，汉族，广东潮州人，硕士研究生，研究员，研究方向为蚕桑资源综合利用。