三种微藻对不同氮源去除率及CO2 固定效率的研究

龙成凤，张达娟，王泽斌，张树林，毕相东，戴伟

（天津农学院 水产学院 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300392）

随着我国工业及城镇化进程加快，工业废水、生活污水、温室气体排放量增加，水体富营养和大气污染等已对生态环境造成严重影响，甚至威胁人类生存和发展[1-3]，因此推广绿色高效的环境修复技术是亟待完成的任务之一。为解决这一问题，20 世纪中叶OSWALD 和GOTAAS 提出用微藻治理污水[4-5]。微藻属于自养型微生物，能将光能转化为化学能，在生长过程中可吸收降解污水中的氮、磷等污染物，从而起到净化水质的作用[6-9]。李超等[10]用四尾栅藻（Scenedesmus quadricauda）和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）去除模拟生活污水中的总氮，去除率分别达到78.33%、76.67%。李兴涵等[11]用小球藻（Chlorellasp.）对天然橡胶加工废水进行处理，结果表明，小球藻对废水中总氮、总磷均具有较好去除效果，去除率分别为89.21 %和70.00 %。

此外，我国在2020 年提出在2030 年前完成碳达峰，争取2060 年前完成碳中和的“双碳”目标。CO2作为主要的温室气体之一，降低其在大气中的含量，对实现“双碳”目标具有重要意义。微藻广泛存在于水体中，可以直接利用光能且繁殖速度快，固定CO2效率是陆生高等植物的10～50 倍[12]。20 世纪末，WERNER 等[13]提出藻类的分子式为C106H263O110N6P，并给出其光合作用反应式：106CO2+16NO3-+HPO42-+122H2O+18H+→C106H263O110N6P+138O2，可以看出微藻能直接利用CO2，大大减少了固碳的时间。另外，由于水体中CO2与空气CO2浓度含量差距较大，且CO2在水体中扩散的速度仅为大气中的万分之一，微藻为了适应水体较低浓度的CO2，建立了一套可以浓缩CO2的机制，以提高细胞内CO2浓度从而保证高效的光合作用，因此，微藻在CO2的减排应用上备受关注。

有些学者将固定CO2和污水处理结合起来，筛选出一些既能固定CO2又能清洁污水的微藻。如：赵云等[14]在光照强度240 μmol/（m·s）、初始氮浓度128 mg/L、通气比0.3 m3/（m3·min）、通气通断间隔15 s/60 s 条件下培养小球藻，研究其对CO2固定和脱氮除磷效果，结果表明在培养期间，小球藻最高固碳速率达到564.67 mg/（L·d），氮、磷去除率分别为66.72%、55.95%。杨枭等[15]在微重力条件下研究小球藻在四种废水中以及通入高浓度二氧化碳时的生长状况，试验结果表明，小球藻在四种废水中均能生长，且能有效吸收氮磷等污染物，通入高浓度CO2时，小球藻的固碳效率有显著提升。耦合CO2减排和污水生态处理微藻资源化培养是现今环境领域关注的主题，但现在大多学者主要关注的是CO2耐受藻的选择及微藻对工业CO2的吸收效果研究，忽略了微藻在自然条件下对CO2的吸收。因此本次试验选取斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）、 绿球藻（Chlorococcumsp.）和普通小球藻为试验对象，研究三种微藻在相同条件下对尿素氮、硝态氮、铵态氮的去除率及对CO2固定的效率。

1 材料与方法

1.1 材料

斜生栅藻、绿球藻和普通小球藻由天津农学院天津市水产生态及养殖重点实验室提供，均培养于BG-11 培养基中，培养条件如下：温度25 ℃，光照强度4 000 lx，光暗比12 h∶12 h。

1.2 试验设计

将对数生长期的斜生栅藻、绿球藻和普通小球藻分别接种至无碳源且以尿素氮（CH4N2O）、硝态氮（NaNO3）和铵态氮（NH4Cl4）为混合氮源的BG-11 培养基中，各氮素质量比为1∶1∶1，氮的质量浓度为247 mg/L，藻细胞初始密度均为1×106cells/mL，培养体积为1.5 L，每组设3 个平行，培养周期为6 d，期间持续通入空气（流速为300 mL/min）以提供碳源，培养条件与藻种培养时一致，每天震荡3 次。取样测定培养液中尿素氮、硝态氮和铵态氮的含量及微藻的细胞密度和干重。

1.3 试验方法

1.3.1 培养液中各成分氮的测定方法

采用锌镉还原法测定硝态氮[16]（GB17378.4-2007），采用纳氏试剂法测定铵态氮[17]（GB17378.4-2007），尿素氮采用国际标准二乙酰一肟分光光度法[18]（GB/T 18204.29-2000）。

1.3.2 微藻细胞密度—吸光度曲线建立

以微藻细胞密度为横坐标，不同密度微藻在750 nm 处的吸光值为纵坐标，分别作出三种微藻与吸光值之间的相关性标准曲线，从而通过测定吸光值确定微藻细胞密度。经测定斜生栅藻、绿球藻和普通小球藻细胞密度与吸光度之间的关系分别为：y＝0.000 6x+0.417 4，R²＝0.997 6；y＝0.001 1x+0.252 1，R²＝0.990 5 和y＝0.000 6x+0.191 4，R²＝0.990 8。

1.3.3 微藻干重-吸光度曲线建立

微藻细胞干重测定是将孔径为0.45 μm 的玻璃纤维滤膜编号后放置于105 ℃烘箱内烘干过夜至恒重后称重，并记录为W1。取不同浓度的栅藻、绿球藻和小球藻藻液各20 mL，通过0.45 μm 玻璃纤维滤膜抽滤，将带有藻体的滤膜分别放于105 ℃烘箱内烘干至恒重，称取其质量W2，各种藻类的两次质量之差即为微藻干重。将不同浓度的三种微藻利用分光光度计于750 nm处分别测定吸光值，并各记录为A。从而建立微藻干重与吸光度之间的曲线。经测定斜生栅藻、绿球藻和普通小球藻三者细胞干重与吸光度之间的关系分别为：y＝1.615 1x+0.396 4，R²＝0.999 8；y＝1.812 7x+0.157 5，R²＝0.998 7 和y＝1.694 7x+0.211 6，R²＝0.993 4。

1.4 微藻比生长率、生物量生产率及CO2 固定速率计算

1.4.1 微藻的比生长率及生物量生产率

微藻的比生长率及生物量生产率计算参考文献[19]，公式如下：

式中：t为培养时间，d；Nt2、Nt1为第t2天和第t1天微藻细胞密度，cells/mL；μ为微藻比生长率，d-1。

式中xP表示微藻生物量产率[g/（L·d）]；Xt表示时间t（d）藻细胞干重（g/L）；X0表示时间t0（d）初始接种液藻细胞干重（g/L）。

1.4.2 微藻CO2的固定速率

微藻CO2的固定速率计算方法参考文献[20]，公式如下：

式中：为CO2固定速率[/（L·d）]；Px为微藻最大生物量产率[g/（L·d）]；Cc 为微藻干细胞含碳率，研究分析表明，微藻细胞干重含碳率为50%；为CO2的分子质量，44；MC为C 原子质量，12。

1.4.3 数据处理与分析

试验数据均用“平均值±标准差”表示，采用Origin 2018、Excel 2019 进行绘图，使用SPSS 单因素方差分析和LSD 多重比较进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 三种微藻生长曲线

如图1 所示，在相同条件下三种微藻生长曲线呈现指数增长，符合微藻生长规律。从第三天开始，三种微藻生长差异显著（P＜0.05），普通小球藻的细胞密度显著高于斜生栅藻和绿球藻（P＜0.05）。第六天时斜生栅藻、绿球藻和普通小球藻细胞密度分别为687.67×104、616.87×104和1161.52×104cells/mL。

图1 三种藻类的生长曲线

2.2 三种微藻比生长率变化及CO2 的固碳速率

微藻比生长率见表1，培养期间三种微藻的比生长率均呈先上升后下降趋势，以第三天时最高；三种藻类间以普通小球藻最高，第三天时为0.87 d-1，显著高于斜生栅藻和绿球藻（P＜0.05）。第六天时，斜生栅藻、绿球藻和普通小球藻的比生长率分别为0.18、0.19、0.15 d-1，三者间无显著差异（P＞0.05）。试验期间，在通入300 mL/min 自然空气情况下，普通小球藻对CO2的固定速率呈先上升后下降的趋势（图2），第三天达到最大值，为0.217 g/（L·d），显著高于绿球藻和斜生栅藻（P＜0.05）；斜生栅藻和绿球藻在第六天达到最大值，分别为0.125 和0.142 g/（L·d），普通小球藻为0.119 g/（L·d），此时三者间无明显差异。

表1 微藻比生长率 d-1

图2 三种微藻CO2 固碳速率

2.3 三种微藻对不同氮源的去除率

斜生栅藻对三种氮源的去除率如图3 所示，自第一天开始，斜生栅藻对尿素氮、硝态氮、铵态氮的去除率存在显著差异（P＜0.05），至第六天时，培养液中三种氮源浓度分别为6.73、73.44、81.54 mg/L，去除率分别为92.86%、79.28%、22.86%，斜生栅藻对尿素氮的去除率显著高于对硝态氮和铵态氮的去除率（P＜0.05）。绿球藻对三种氮源的去除率在第二天开始存在显著差异（P＜0.05），第六天时，培养液中尿素氮、硝态氮和铵态氮的浓度分别为20.78、70.56 和64.00 mg/L，绿球藻对硝态氮的去除率为80.10%，显著高于对尿素氮（77.98%）和铵态氮（39.45%）的去除率。可见绿球藻对硝态氮的去除效果优于尿素氮和铵态氮。普通小球藻对三种氮源的去除率从第三天开始存在显著性差异（P＜0.05），第六天时，培养液中尿素氮、硝态氮、铵态氮浓度分别为35.89、67.20、69.07 mg/L，对三种氮源的去除率分别为61.96%、81.04%、34.66%，三者间存在显著差异（P＜0.05），说明普通小球藻对硝态氮的去除效果最好。

图3 三种微藻对不同氮源的去除率

3 讨论

3.1 三种微藻的生长及固碳速率

微藻由于自身的结构特性，能够进行光合作用，合成有机物，满足自身生长需求并储存多余能量。通过食物链，将固定的碳传递至鱼类、鸟类或哺乳类等高等生物，这些生物的排泄物又可被低等生物利用。经食物链的传递，一部分碳被固定进入底泥，另外一部分被移出水体。相对于森林储存的碳几百年内大部分会重返大气，储存在水体中的碳则几乎很少返回大气[21]。据测算小球藻、栅藻和水华鱼腥藻含碳量分别达46.38%、51.28%和68.76%。因此藻类被公认为提高碳汇的重要载体。了解微藻的自然生长及固碳速率可以为碳汇测算提供理论基础。

本研究中三种藻类在培养期间细胞密度随时间的增加而增加，说明在该条件下三种微藻均能正常生长。三种微藻比生长率逐渐上升在第三天达到最大值，随后降低，其中普通小球藻的平均比生长率高于绿球藻和斜生栅藻，说明普通小球藻在培养期间物质积累最多，且藻种不同物质积累的速率也有差异。

CO2作为光合作用的必要条件之一，其固定速率反应了微藻对CO2的吸收转化能力，对我们筛选和评价微藻固定CO2能力有重要意义。不同微藻固碳能力不同[22]，因此了解微藻的固碳差异对后续研究具有现实意义。刘明升等[23]对水华鱼腥藻（Anabaena flos-aquae）、小颤藻（Oscillatoriatenuis）、阿氏颤藻（Oscillatoria agardhii）、水网藻（Hydrodictyon reticulatum）、斜生栅藻和鞘藻（Oedogonium sp.）六种淡水微藻在相同条件下进行培养，发现六种微藻的固碳速率有显著差异；卫晴等[24]以藻液初始浓度A680＝0.3±0.1 接种，无碳的BG-II 培养基为基础通入0.04%、5.00%和20.00%的CO2（v/v），气体流量为200 mL/min 的条件下，研究两株绿藻对CO2浓度响应，结果表明在0.04%条件下小球藻FACHB-1580 和栅藻FACHB-1618 CO2平均固定效率分别为0.352 和0.425 g/（L·d），5.00%和20.00% CO2条件下平均固碳速率均高于0.04%。本文中普通小球藻、绿球藻和斜生栅藻平均固碳速率分别为0.115、0.096和0.067 g/（L·d），说明在整个培养期间，普通小球藻吸收的CO2比绿球藻和斜生栅藻多，具有较好效果。其中普通小球藻与斜生栅藻平均固碳速率低于卫晴的试验结果，这可能与微藻初始浓度及氮源不同有关。普通小球藻固碳速率在第三天出现拐点，这是由于细胞密度较大，藻液对光的掩蔽效应增强，光合作用变弱。

3.2 微藻对不同氮源的吸收和利用

微藻能直接利用水体中的铵态氮，通过转氨基，迅速合成自身所需氨基酸；而硝态氮和尿素氮需要经过硝酸酶和尿素酶通过还原和脱羧产生铵态氮，最终被微藻吸收[25]。当硝态氮、尿素氮作为唯一氮源时，藻类生长需要面临更多的还原压力，因此硝态氮、尿素氮被认为不是一种经济的生存策略。但不同微藻对不同形态的氮源利用存在差异，且对浓度要求也不一样，如：低浓度铵态氮促进铜绿微囊藻生长，高浓度会对其产生生长胁迫[26]。

研究发现，硝酸氮是小球藻最适氮源，而王顺昌等[27]发现尿素对蛋白小球藻生长、色素积累优于硝态氮和铵态氮；胡章喜等[28]研究不同氮源对布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）生长、总脂和总烃含量的影响中发现硝态氮是布朗葡萄藻764 和布朗葡萄藻765 较好的氮源；胡章喜等[28]指出相同条件下，亚心形扁藻（Platymonassubcordiformis）对尿素氮的去除利用优于硝态氮和铵态氮，可见微藻种类、培养条件均会影响其对氮源的吸收。本试验中，三种微藻均能利用尿素氮、硝态氮、铵态氮，且尿素氮和硝态氮的去除率均显著高于铵态氮，说明三种微藻对不同氮源去除存在差异。斜生栅藻对三种不同氮源去除率为：尿素氮＞硝态氮＞铵态氮，绿球藻为：硝态氮＞尿素氮＞铵态氮，普通小球藻为：硝态氮＞尿素氮＞铵态氮，三种微藻对不同氮源的去除率均不同，与微藻优先利用铵态氮的说法有所差异。我们认为是同一微藻在单一氮源和混合氮源中对氮源的吸收有所差异造成的。马红芳等[29]的研究结果表明，斜生栅藻偏好铵态氮，但杨坤等[30]在栅藻和小球藻对养殖废水的试验中，发现在混合氮源中，硝态氮的浓度大于铵态氮时，硝态氮的存在会抑制微藻对铵态氮的吸收。本文三种微藻铵态氮去除率最低，与上述结论相符。除此之外，对比三种微藻发现，不同微藻在相同混合氮培养下，单一氮源对其他形式氮源的影响也具有差异。斜生栅藻尿素氮抑制硝态氮和铵态氮的吸收，绿球藻及普通小球藻硝态氮抑制尿素氮和铵态氮的吸收。因此，选择微藻处理污水时，既要考虑微藻的特性也要考虑其他氮源的影响。