基于STAT3-CASP4/5 通路诱导银屑病细胞焦亡基因调控网络的构建及潜在药物预测

王家悦，陈朝霞，王 燕，赵京霞，底婷婷，胡雪晴，曲保全，李 萍

首都医科大学附属北京中医医院，银屑病中医临床基础研究北京市重点实验室，北京市中医药研究所，北京 100010

银屑病是一种常见的自身免疫性疾病，其发病机制尚不完全清楚[1]。目前普遍认为，银屑病的发病是由表皮角质形成细胞（keratinocyte，KC）与免疫细胞互作异常引起的自身炎症反应，导致皮肤受累。近年来，研究发现半胱氨酸蛋白酶-11（cysteine aspartatespecific proteinase-11，Caspase-11，CASP-11）促进了与细胞焦亡相关的银屑病的发展。对缺乏CASP-11 的小鼠进行组织学和基因表达研究表明，CASP-11 的表达可以通过促进KC 增殖、免疫细胞浸润和新血管生成来增强咪喹莫特诱导的银屑病症状，以支持该过程中异常增殖的KC 的代谢需求[2]。又有研究证实，CASP-11 可激活银屑病小鼠骨髓源性巨噬细胞中的炎症小体，焦孔素 D（gasdermin-D，GSDMD）作为炎性CASP 的共同底物蛋白被切割释放其N 端结构域，破坏细胞膜的功能，导致膜上孔隙形成，致使促炎细胞因子白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 的成熟和分泌并启动细胞焦亡[3]。虽然这些证据表明，细胞焦亡过程是银屑病发病的途径之一，它们之间的联系是通过抑制CASP 驱动的细胞焦亡干预诱导的银屑病小鼠的病理症状来建立的，但是调控CASP基因表达进而诱发细胞焦亡过程转录机制尚不清晰。因此，本研究采用基于基因调控网络的方法来识别与银屑病病理过程中细胞焦亡相关的基因进而揭示在银屑病的病理学中CASP 诱发细胞焦亡上游调控机制。

在银屑病的西医治疗方法中，环孢素 A（cyclosporine A，CysA）作为一种高选择性免疫抑制剂用于控制严重的斑块型、脓疱型银屑病，效果明显[4]。最近的研究表明，CysA 可以通过抑制线粒体渗透性过渡孔的开放来减少细胞焦亡的发生，提示CysA 可能通过调控异常的细胞焦亡过程来治疗银屑病[5]。此外，中药治疗银屑病的疗效确切，经临床实践及动物研究证明，中药在抑制炎症细胞浸润、抑制KC 异常的增殖分化过程等方面具有明显优势[6-8]，并有研究表明中药还可干预细胞焦亡的进程[9-10]。本研究通过分析银屑病病患的基因表达数据构建CASP基因上游转录调控网络，通过整合临床知识和生物医疗数据库预测在银屑病发病过程中调节细胞焦亡基因表达的中西药物（研究流程见图1），为银屑病的治疗提供新的研究方向。

图1 STAT3-CASP4/5 通路诱导银屑病细胞焦亡基因调控网络构建及潜在药物预测的研究流程Fig. 1 Research process of constructing regulatory network for psoriatic cell pyroptosis gene induced by STAT3-CASP4/5 pathway and potential drug prediction

1 材料与方法

1.1 数据收集

利用NCBI 的基因表达Omnibus 数据库（GEO）获得银屑病患者皮损区和非皮损区样本的基因表达数据（GSE109248）。使用GEOquery 包（2.66.0 版本）从GEO 数据库中下载 17 例银屑病样本（GSM2935867～GSM2935883）和14 例健康皮肤对照组样本（GSM2935853～GSM2935866），样本分布信息见图2-a，样本标准化情况见图2-b。此外，通过检索细胞焦亡相关文献报道[11-14]，收集前期研究已鉴定出的52 个细胞焦亡相关基因。

图2 银屑病皮损区和正常区皮肤组织样本分布Fig. 2 Distribution of skin tissue samples from psoriasis lesions and normal areas

1.2 方法

1.2.1 银屑病差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的分析和筛选 使用R 语言（4.2.2 版本）在Ubantu 平台（22.04 版本）上进行数据分析。使用Limma 包（3.54.2 版本）分析GSE109248 数据集中银屑病患者皮损区和非皮损区组织样本之间的差异表达基因（银屑病DEGs），筛选条件为P≤0.01。使用 DrawVennDiagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be）工具绘制韦恩图鉴定比较银屑病DEGs 和52 个细胞凋亡DEGs 相关基因的交集。

1.2.2 细胞焦亡银屑病DEGs 基因本体（gene ontology，GO）富集分析 使用WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit（WebGestalt 2019）[15]对银屑病和细胞焦亡相关基因进行富集分析，筛选条件为P≤0.01，鉴定相关生物过程及对应拓扑关系。

1.2.3 构建转录调节网络 基于Python（3.8.16 版本）在Ubantu 平台（22.04 版本）上预测银屑病DEGs的转录调节关系网络。使用基于随机树基因相关性算法GENIE3[16]预测银屑病DEGs的上游转录因子，并提取相关性最高的0.5%调节关系。从预测的调节关系中，分别提取直接调节细胞焦亡和间接调节细胞焦亡的调节因子并使用Cytoscape 软件（3.8.0 版本）绘制预测的调节网络。

1.2.4 化学药筛选 使用Coremine 综合数据库（https://coremine.com/medical/）和DGIdb 综合数据库（https://www.DGIdb.org）[17]预测作用在核心基因（Hub）转录因子的批准的药物分子，数据库包含NCBIEntrez、DrugBank、PharmGKB 等临床试验数据及PubMed 发表的工作内容。

1.2.5 中药筛选 将细胞焦亡过程和银屑病发病过程的交集基因及调节这些基因的转录因子提交至CTD综合数据库（https://ctdbase.org/），查找能够调控这些基因的化学成分，选取CTD 数据库中文献支持数较高的化学成分，在COREMINE 数据库（https://coremine.com/medical/）中寻找包含对应化学成分的中药。参考《中国药典》《中药大辞典》《中华本草》《中药学》等对这些中药进行性味归经和药物分类的统计分析。

2 结果

2.1 银屑病患者皮损区和非皮损区样本的基因表达分析

根据筛选结果显示，共有6408 个探针样本表现出差异表达，且差异显著（P值为0.01）。银屑病DEGs 总计为5172 个。结果见图3。

图3 银屑病DEGs 均值-差异图Fig. 3 Mean-difference plot of psoriasi s DEGs

对银屑病DEGs 进行富集分析，发现其涉及多个生物过程，具体见图4。研究结果表明，在皮肤病变区域中，银屑病DEGs 与细胞凋亡、细胞增殖、细胞迁移等生物过程密切相关，这些过程异常状态下涉及T 细胞、B 细胞、树突状细胞、巨噬细胞等免疫细胞的活化和功能异常。这些异常的免疫细胞活动往往伴随着银屑病的发生，并导致病变区域出现角化不良、表皮屏障功能紊乱、炎症细胞浸润和鳞屑形成等病理特征。因此，研究结果显示银屑病DEGs 的差异表达与银屑病病程的发展密切相关。

图4 银屑病DEGs 的有向无环图Fig. 4 GO directed acyclic graph of psoriasis DEGs

2.2 银屑病相关细胞焦亡基因的筛选及其富集分析

为进一步探究细胞焦亡基因在银屑病发病过程中的作用，比较2 个生物过程涉及的表达基因，发现了13 个共同的DEGs（图5-a）。这些基因包括与细胞凋亡途径相关的半胱氨酸蛋白酶 5（cysteinasparate protease 5，CASP5）、CASP4、CASP3、CASP9和CASP8基因；与调节细胞内分泌途径和蛋白质分解途径相关的带电多囊体蛋白6（charged multivesicular body protein 6，CHMP6）、CHMP2A和CHMP7基因；与炎症途径相关的IL-1β基因；参与核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide binding oligomerization domain containing，NOD）样受体途径的NOD1和PYD 和CARD 结构域包含蛋白（PYD and CARD domain containing，PYCARD）基因；与B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族凋亡相关的Bcl-2 相关X 蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）基因；以及编码蛋白激酶A 家族的cAMP 依赖性蛋白激酶α催化亚基（protein kinase cAMP-activated catalytic subunit alpha ，PRKACA）基因，基因名称如表1 所示。

图5 银屑病相关细胞焦亡基因的筛选及其富集分析Fig. 5 Screening and enrichment analysis of psoriasis related pyroptosis genes

表1 银屑病与细胞焦亡共同差异表达基因Table 1 Differential expression genes of psoriasis and pyroptosis

进一步对筛选出来的13 个共同的DEGs 进行富集分析，GO 分析结果见图5-b，GO 有向无环图结构见图5-c。结果显示，包括CASP4、CASP5、CASP8在内的细胞焦亡基因在银屑病中参与程序性细胞死亡的调节、蛋白酶活性的调节、内肽酶活性的调节、IL-1β 的产生等过程。进一步预测这些共同DEGs 的上游转录调节机制，以识别调控细胞焦亡生物过程和银屑病病理过程的关键转录因子，进而描绘2 个生物过程交互的可能基因调控网络。

2.3 银屑病与细胞焦亡共同DEGs 的上游转录调控网络

通过基因相关性分析，筛选出54 个转录因子调控7 个细胞焦亡和银屑病共同DEGs（CHMP7、CASP8、CASP5、CHMP2A、CASP4、IL1B、BAX），共对应64 个转录调控关系（图6）。预测的转录调控网络模型并不完全联通，而是划分为CASP8调控网络（图6-a）、CASP5/CASP4调控网络（图6-b）、Bax调控网络（图6-c）、IL1B调控网络（图6-d）、CHMP2A调控网络（图6-e）、CHMP7调控网络（图6-f）6 个独立的上游转录调控网络。这可能意味着这些基因的表达机制在银屑病的发病过程中呈现出相互独立的模式。

图6 银屑病-细胞焦亡基因调控网络模型Fig. 6 Regulatory network model of psoriasis-pyroptosis gene

研究发现与细胞焦亡过程和银屑病发病过程共同DEGs（图6 中以橘黄色标记）直接调节的转录因子（以红色标记）比间接调节的转录因子（以蓝色标记）具有更多的输入调节和输出调节关系，表明直接调节因子在调控网络中可能具有重要的功能。更具体地，对于在细胞焦亡过程中发挥重要作用的CASP基因，发现转录调节因子维生素D 受体（vitamin D receptor，VDR）、钙调蛋白结合转录激活因子2（calmodulin binding transcription activator 2，CAMTA2）和锌指E 盒结合同源盒蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2）可能直接调节CASP8的转录过程；转录因子转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、碱性亮氨酸拉链ATF 样转录因子2（basic leucine zipper ATF-like transcription factor 2，BATF2）和催乳素调节元件结合蛋白（prolactin regulatory element binding，PREB）直接调节CASP4、CASP5的转录过程。根据以往研究，银屑病的发病机制之一涉及通过抑制CASP 驱动的细胞焦亡来干预诱导银屑病小鼠的病理症状[2-3]。寻找的上游转录因子可能是通过调节细胞焦亡过程逆转银屑病症状的关键基因节点。此前本团队研究表明，在咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型的皮损中，pSTAT3 表达明显上调。K5.STAT3C 转基因小鼠也表现出典型的银屑病样皮损改变。通过STAT3 抑制剂或沉默干扰RNA阻断STAT3 的激活，可以抑制模型的皮损发生。这些研究证明了STAT3 在银屑病中的调节功能，并验证了本研究预测的包括STAT3 在内的CASP基因上游转录调节因子，可能被用于寻找逆转银屑病病症的药物分子。随后将系统筛选作用于这些重要转录因子的药物分子，旨在寻找可能逆转异常细胞焦亡过程的治疗银屑病的方案。

2.4 药物-基因相互作用

为进一步探索寻找逆转银屑病病症的药物分子，在COREMINE 数据库中搜索了作用于CASP基因的关键转录因子（包括STAT3）的治疗药物。结果显示，与STAT3 相互作用的药物有151 个，与VDR 相互作用的有52 个，与ZEB2 相互作用的有31 个，与BATF2 相互作用的有11 个，与PREB 相互作用的有6 个，与CAMTA2 相互作用的有4 个（P＝0.01）。其中，CysA、MTX 和异维A 酸与VDR和STAT3 均有作用，表明这3 种药物可能通过作用于包括VDR 和STAT3 在内的多个基因靶点来逆转银屑病症状。这些药物的银屑病调节功能可以通过DGIdb 数据库得到验证。

进一步探索多靶向药物分子是否作用于其他CASP 通路基因，发现这3 种药物均调节CASP4和CASP8基因，而CysA 还作用于ZEB2 转录调节因子。在银屑病-细胞焦亡网络药物筛选结果中，CysA、MTX 和异维A 酸这3 种药物已被广泛应用于治疗银屑病和其他自身免疫性疾病。研究结果表明，这3 种药物可能通过调节细胞焦亡过程中的CASP 活性，在银屑病的治疗中发挥一定的作用。此外，本研究还进一步探索可能作用于CASP 家族基因及其上游基因调节网络的中药。

2.5 基于银屑病-细胞焦亡基因网络的中药预测

为探索治疗银屑病的中医药解决方案，希望预测中药及其化学成分通过干扰细胞焦亡与银屑病的互作通路表达实现诊疗效果。为此，提交CASP 及其直接的上游转录因子至CTD 数据库，并检索对这些基因具有调控作用的化学成分。选择CTD 数据库中文献支持度高的化学成分，将这些化学成分提交至COREMINE 数据库检索含有这些化学成分的中药，选择具有显著统计学差异（P＜0.05）的中药。结果显示，99 味中药作用于CASP基因及其上游调节因子，其中61 味中药作用于细胞焦亡与银屑病重叠基因CASP4、CASP5、CASP8，66 味中药作用于转录调节因子 STAT3、VDR、ZEB2、CAMTA2、PREB 和BATF2（表2）。其中土茯苓、甘草、白花蛇舌草、白术、当归、茯苓、赤芍、地黄、牡丹皮、防风、茜草、黄芩、丹参、川芎、苍术、菟丝子、桂枝17 味中药在本课题组的临床实践中得到广泛应用[18]。这17 味中药有11 味归肝经，8 味归脾经，意味着肝经和脾经在银屑病和细胞焦亡过程中可能发挥重要作用。这与本课题组之前的研究结果相一致，研究发现通过咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠在肝郁状态[19]或脾虚状态[20]下皮损严重程度尤为显著。这些发现不仅验证了基于基因网络模型寻找到的中药治疗方案，也为中医归经论治提供了新的思路。基于此，对发现的99 味中药进行性味归经统计，旨在进一步探索经络和细胞焦亡调节的银屑病发病过程的关系。

表2 作用于细胞焦亡与银屑病重叠互作的直接调节因子Table 2 Direct regulator of overlapping interactions between pyroptosis and psoriasis

2.6 用药频次分析

为探索细胞焦亡调节的银屑病发病过程中的经络特点，根据《中国药典》《中药大辞典》《中华本草》《中药学》等药典书籍对被筛选出的中药进行统计，发现中药功能以清热药（20 次）、补虚药（16次）为主；药味以苦（55 次）、辛（44 次）、甘（41次）为主；药性以寒/微寒（38 次）、温/微温（32 次）、平（17 次）为主；归经以肝经（48 次）、肺经（43次）为主，较多涉及脾经（38 次）、心经（37 次）、胃经（31 次），见图7。用药频次结果与本课题组临床用药习惯一致，意味着肝经用药可能通过调节细胞焦亡影响银屑病发病过程。同时，本研究结果也与近年来针对银屑病作为心身疾病的属性所提出的“从肝论治银屑病”的理论相一致。首都医科大学附属北京中医医院皮肤科采用清肝凉血解毒方作为从肝经论治银屑病的基础方，相关研究结果表明从肝经论治银屑病在治疗过程中表现出良好的疗效。此外，《素问·五脏生成篇》中提到“肺之合皮也，其荣毛也”的理论，说明肺在银屑病治疗中的重要地位。因此，归经属肝、肺和脾经的中药可能通过影响细胞焦亡过程影响银屑病病程。

图7 用药频次分析Fig. 7 Analysis of medication frequency

3 讨论

抑制CASP 驱动的角质形成细胞过度增殖是细胞焦亡过程调节银屑病发病的机制之一，但是对于发病过程中的CASP基因表达的上游转录调节研究尚且缺乏。通过对银屑病皮损组织和对照组织进行基因表达谱分析，发现包括CASP4、CASP5、CASP8、Bax、IL1B、CHMP2A以及CHMP7在内的13 个基因参与细胞焦亡调节的银屑病发病过程，其中一些基因已被现有研究证实与细胞焦亡及银屑病相关。临床研究表明，细胞焦亡的特征是KC 产生IL-1β[21]，其在皮肤组织中的表达升高导致银屑病患者皮损区域脓疱和水肿现象增多[22-23]，并且在咪喹莫特诱导的小鼠体内也能观察到IL-1βmRNA 表达增强[24]。银屑病慢性期表皮CASP8的表达下调可介导p38 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/核因子-κB（nuclear factor kappa B subunit，NF-κB）/aspase-1/IL-1α 信号通路，导致S100 钙结合蛋白A7（S100 calcium binding protein A7，S100A7）和IL-1α 分泌增加；银屑病急性期CASP8表达下调可导致银屑病患者皮肤中抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）的持续释放增加，有助于防御皮肤感染[25]。CASP4、CASP5联合CASP11、细菌脂多糖形成非经典炎症小体复合物，参与细胞膜破裂和裂解以及炎性因子如IL-18 和IL-1β 的释放过程，导致银屑病的发生和发展[26]。此外，细胞焦亡相关的Bax基因高表达可抵抗银屑病皮损组织KC 凋亡[27]，从而减轻银屑病的症状。这些研究验证了细胞焦亡可通过基因表达异常、多种细胞因子失衡和信号转导异常方面调控银屑病的发病进程。

基于计算重构的细胞焦亡过程和银屑病发生过程共同基因的上游转录调节网络，探索了可能的靶点基因。发现包括STAT3、VDR、KLF3、RREB1、ATF6B、ZEB2 和KLF15 等转录调节因子通过调控细胞焦亡过程影响银屑病的发生和发展。其中已有研究证实，STAT3 转录因子通过多个通路参与银屑病。具体而言，KC 增殖和激活过程中分泌的C-X-C 模体趋化因子配体（C-X-C motif chemokine ligand 1/2，CXCL1/2）和IL-8 对树突状细胞、T 细胞和巨噬细胞等免疫细胞的活性产生刺激作用，并调节 IL-6、IL-8、IL-21、CCL20、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等细胞因子的表达。本研究预测发现，STAT3 可能作为上游转录因子调节CASP4基因的表达进而影响细胞焦亡过程参与银屑病病程。此前的研究发现，CASP4和CSAP5共同参与非经典炎症小体复合物的形成，通过激活GSDMD介导的细胞焦亡过程最终导致炎性因子的释放，促进KC 增殖和角化异常[13]。本研究不仅预测了STAT3参与了GSDMD 相关信号通路，还发现BATF2 和PREB 以及STAT3 3 个转录因子共同调节CASP4和CSAP5，这意味着这些转录因子可能共同参与调控GSDMD的上游基因调控网络。本研究预测了一个崭新的机制，即STAT3 通过调节CASP4和CSAP5下游通路参与调控KC 的增殖和角化过程。另外，转录调节因子VDR 通过降低细胞焦亡相关蛋白的表达来调节细胞焦亡的发生。VDR 激动剂可以显著减轻银屑病的症状和促进皮肤愈合，VDR 水平越低，银屑病的面积和严重程度指数（PASI 评分）越高。研究发现，在银屑病中VDR 可以通过转录调节CASP8的表达，从而可能调节STAT3-GSDMEC-CASP8 通路，进而影响角质形成细胞的分化和增殖。利用COREMINE 综合数据库筛选了以STAT3-CASP 通路为中心的化学药和中药的相关信息，发现CysA、MTX 以及异维A 酸可以作用于包括STAT3、VDR 和ZEB2 在内的转录调节因子，以及包括CASP4和CASP8在内的Caspase 基因家族（图8）。

图8 STAT3-CASP4/5 通路诱导银屑病细胞焦亡基因调控网络 (由BioRender 网站绘制)Fig. 8 Induction of psoriasis cell apoptosis gene regulatory network through STAT3-CASP4/5 pathway (created with BioRender.com)

为探索治疗银屑病的中医药解决方案，本研究使用CTD 和COREMONE 数据库获得99 味以STAT3-CASP 通路为潜在靶点的中药。其中清热药物的应用最为广泛，涉及清热解毒药和清热凉血药，这体现了银屑病的主要病机是以“毒”为首要致病因素，而“血分有热”是其核心病理机制。此外，99 味预测药物中有17 味中药在临床上被应用于治疗银屑病，且主要归于肝、脾经。进一步统计预测药物的中药性味和归经，发现预测的中药药性以寒、温、平为主，药味多为苦、辛、甘，归经多属于肝经和肺经。尽管寒与温、苦与甘看似是相对的属性，但在治疗银屑病时并不矛盾。这是因为银屑病的病机主要是血热，而苦味药物具有清热泻火、凉血解毒的功效，因此临床上常用苦寒药物，如黄连、黄芩等。然而，由于银屑病病程长久，为了避免久服苦寒药物对中焦阳气的伤害，通常会配合甘温之品以制衡，如甘草、白术等。因此，尽管寒与温、苦与甘看似是相对的，但当它们在配伍应用时，能够协同作用，相互制约，共同发挥治疗作用。将中医传统的宏观整体辨证理论，包括识证、选方和遣药，与基于基因和蛋白质的微观辨证相结合，使中医辨治更加精准化。这种结合为中医药的“守正创新“提供了新的途径。

4 结论

本研究探讨了参与细胞焦亡的基因在银屑病发病机制中的共同调控作用，构建了细胞焦亡在银屑病中差异表达的基因所涉及的信号通路网络，以及与网络中心节点存在相互作用的潜在中药治疗药物。本研究为后续研究细胞焦亡基因在银屑病发病过程中发挥的作用提供了崭新的分析解决方案，但就目前的研究现状来看，细胞焦亡基因的表达情况及机制仍未完全阐明，细胞焦亡基因在银屑病发病过程中的作用仍需要进一步探索，中医药能否直接调控细胞焦亡通路，仍需要进一步进行大规模的基础实验验证和临床观察。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突