基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术对藏药宽筋藤中生物碱类成分的快速辨识

张武岗，郎一帆，姚 云，杨武亮，杨世林，陈海芳*，冯育林*

1. 江西中医药大学 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330004

2. 江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004

宽筋藤（译名勒哲）为防已科植物中华青牛胆Tinosporasinensis(Lour.) Merr.的干燥茎藤，收载于《藏药标准》，具有舒筋活络、祛风止痛等功效，常用于治疗跌打损伤、风湿痹痛等[1]。现代临床研究表明，宽筋藤对风湿性关节炎具有良好的治疗效果[2-4]，生物碱是其主要的抗炎活性成分，小檗碱[5-6]、药根碱[7]等能够明显改善大鼠类风湿性关节炎症状。但是，目前对宽筋藤中生物碱类成分的报道仅有非洲防己碱、药根碱、四氢巴马汀、小檗碱、巴马汀等[8-13]，未有全面分析，为探寻宽筋藤中更多治疗风湿性关节炎的生物碱类成分，本研究采用UPLC-Q-TOFMS/MS 技术分析宽筋藤中生物碱类成分，为宽筋藤的后续研究开发提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

Tripie TOF 5600 Plus 型高分辨质谱仪、Analyst TF1.6、peakview 1.2 数据处理系统（美国Sciex 公司）；LC-30A 型超高效液相色谱仪，包括LC-30AD高压输液泵、CBM-20A 系统控制器、SIL-30AC 自动进样器、DUG-20A5 在线脱气机、CTO-30A 柱温箱（日本岛津公司）。

1.2 材料与试剂

宽筋藤（批号20150329）购自成都荷花中药材专业市场，经江西中医药大学徐艳琴教授鉴定为防己科植物中华青牛胆T.sinensis(Lour.)Merr.的干燥茎藤。甲醇、乙腈（色谱纯）购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；蒸馏水由屈臣氏集团提供；其余试剂为分析纯。对照品小檗碱（批号19072501）、巴马汀（批号19022604）、四氢巴马汀（批号16032710）、黄柏碱（批号17112110）、木兰花碱（批号18071701）、木兰箭毒碱（批号20092304），以上对照品质量分数均大于98%，购自成都曼斯特生物科技公司；盐酸、三氯甲烷、浓氨水、无水乙醇均为分析级，购自成都科隆化学品有限公司；地塞米松（批号C100916501）购自上海麦克林生化科技有限公司；脂多糖（批号017M4112V）购自美国Sigma 公司；胎牛血清（FBS，批号233473CP）、DEME 培养基（批号L110KJ）购自美国Gibco 公司；一氧化氮检测试剂盒（批号20220312）购自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

分别精密称定各对照品适量，用甲醇溶解制备对照品储备液。精密吸取各对照品储备液适量，于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得小檗碱、巴马汀、四氢巴马汀、黄柏碱、木兰花碱、木兰箭毒碱质量浓度分别为45.76、19.31、31.23、26.18、25.76 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

将宽筋藤药材30 g 置于圆底烧瓶中，加入10倍（300 mL）70%乙醇，加热回流提取2 次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩得到1.92 g 浸膏。取浸膏加20 mL 2%盐酸水溶液，搅碎搅拌，放置4 h，滤过，滤液加浓氨水调PH 至9～10，氯仿萃取，回收氯仿，得宽筋藤生物碱0.12 g。

2.3 液相色谱条件

采用Waters UPLC C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm)，流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0.01～5 min，5%～8% B；5～20 min，8%～15% B；20～25 min，15%～30% B；25～38 min，30%～95% B；38～38.01 min，95%～5% B；38.01～40 min，5% B。体积流量0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 µL。

2.4 质谱条件

使用电喷雾离子源（ESI），正离子模式，质量扫描范围为m/z100～1250；喷雾电压4500 V；离子化温度500 ℃；碰撞能量35 eV；气帘气206.85 kPa；雾化器和辅助气均为344.75 kPa；去簇电压100 V；数据采集时间40 min。

2.5 数据处理

采用AB Sciex 公司的软件PeakView 1.6 中的XIC Manager、Mass Calculators 和Formula Finder功能，对UPLC-Q-TOF-MS/MS 采集的数据进行处理。

2.6 抗炎活性研究

2.6.1 细胞活力实验 采用CCK-8 法检测宽筋藤生物碱对RAW264.7 细胞的毒性。取对数生长期的RAW264.7 细胞用含10% FBS 培养液的DMEM 培养基调整细胞密度至1×104个/mL，接种于96 孔板中，将含不同药物浓度宽筋藤生物碱的细胞培养液以100 μL/孔加入96 孔板中，另设对照组中加入无药物的细胞培养液，每组6 个复孔。于37 ℃、5% CO2培养24 h 后，弃去上清液加入10%的CCK-8 溶液，每孔100 μL，于酶标仪450 nm 处测定吸光度（A）值，计算细胞存活率。

2.6.2 抗炎活性检测 采用Griess 法测定宽筋藤生物碱对脂多糖诱导的RAW264.7 细胞产生一氧化氮的抑制作用。取对数生长期的RAW264.7 细胞接种于96 孔板中（5×104个/孔），37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，弃去旧培养基，给药组分别加入100 μL 宽筋藤生物碱（15.63、31.25、62.50、125.00 μg/mL）的DMEM 培养基，同时设置对照组（仅培养液）、模型组（仅培养液）和地塞米松（40 μmol/L 地塞米松＋培养液）组，培养1 h 后，除对照组外，其余各组加入100 μL 的脂多糖（1 μg/mL）溶液，继续培养24 h 后，每孔吸取50 μL 上清液于新的96 孔板中，先后加入Griess I 液50 μL 与Griess II 液50 μL，用酶标仪在540 nm 处测其A值，计算一氧化氮抑制率。

3 结果

3.1 生物碱成分的分析鉴别

为便于对宽筋藤生物碱的化学成分进行分析，首先从CNKI、GoogleScholar、scifinder 等数据库中检索宽筋藤化学成分，再通过 chemspider、chembook、massbank、Pubmed 数据库等获取对应成分的化学成分信息，包括化合物的名称、分子式、相对分子质量等信息，以此建立宽筋藤的生物碱化合物数据库。在此基础上，通过 UPLC-QTOF-MS/MS 正离子模式共检测出89 个化合物，鉴定出73 个生物碱，见表1，包括12 个原小檗碱型生物碱、23 个四氢原小檗碱型生物碱、20 个苄基异喹啉类生物碱、9 个阿朴啡类生物碱、9 个其他类生物碱。宽筋藤提取液基峰图（BPI）如图1所示。

表1 宽筋藤生物碱成分鉴定结果Table 1 Results of identification of alkaloid constituents of Tinospora sinensis

续表1

续表1

图1 正离子模式下宽筋藤提取物的基峰图Fig. 1 BPI chromatogram of the Tinospora sinensis extracts in positive mode

3.2 原小檗碱类生物碱

原小檗碱类生物碱由于碳碳单键的存在，使母核很容易失去2 个氢而形成稳定的大π 共轭系统，所以原小檗碱类生物碱的母核一般不会发生裂解，主要碎片离子是由小分子取代基的掉落形成，很少存在低于m/z230 的产物离子。当取代基包含2 个或多个甲氧基时，特征碎片离子为 [M－CH4]+、[M－CH3]+和 [M－2CH3]+，如小檗碱和巴马汀。结合碎片离子及文献，共鉴定出原小檗碱类生物碱共12 个，分别为化合物26、55、60、62、64、70、73、77、79、80、82 和83。

化合物55 为小檗碱，分子式为C20H18NO4，在正离子模式下，准分子离子峰为m/z336.123 8 [M]+。小檗碱含有邻二甲氧基，产生了特征碎片离子m/z321.099 6 [M－CH3]+、320.091 6 [M－CH4]+、306.077 6 [M－2CH3]+，在二级质谱中还可以观察到由m/z320.091 6 [M－CH4]+相继失去CO 和CH3产生的碎片离子m/z292.096 2 [M－CH4－CO]+、277.074 1 [M－CH4－CO－CH3]+和249.078 5 [MCH4－2CO－CH3]+。其裂解途径见图2。

图2 小檗碱的MS/MS 图与裂解途径Fig. 2 MS/MS spectrogram and fragmentation pathway of berberine

化合物80 为巴马汀，分子式为C21H22NO4，在正离子模式下，准分子离子峰为m/z352.153 9[M]+。在二级质谱中，可以观察到特征碎片离子m/z336.122 8 [M－CH4]+，以及由碎片离子m/z336.122 8 [M－CH4]+相继失去CO 和CH4的碎片离子m/z308.128 3 [M－CH4－CO]+、292.097 4 [M－2CH4－CO]+。其裂解途径见图3。

图3 巴马丁的MS/MS 图与裂解途径Fig. 3 MS/MS spectrogram and fragmentation pathway of palmatine

化合物70 和73：化合物70，在正离子模式下，准分子离子峰为m/z338.138 0 [M]+，分子式为C20H20NO4。在二级质谱中，可以观察到特征碎片离子m/z323.115 6 [M－CH3]+和m/z322.107 4 [MCH4]+，表明该化合物取代基包含2 个或多个甲氧基。同样可以观察到丢失了CH3和CH4的碎片离子m/z307.084 9 [M－CH4－CH3]+以及丢失了CH4、CH3和CO 的碎片离子m/z279.089 3 [M－CH4－CH3－CO]+，结合文献报道[18,21,24,26,29]推测化合物70 为非洲防己碱，可能的裂解途径见图4。化合物73 的二级碎片为m/z338.138 1, 323.115 7, 322.107 1, 307.084 3, 294.112 2, 279.089 0, 250.086 4，其二级碎片信息与非洲防己碱的二级碎片相同，失去了一系列的CH4、CH3和CO。根据参考文献及此类化合物的裂解规律，推测化合物73 为药根碱。

图4 非洲防己碱的MS/MS 图与裂解途径Fig. 4 MS/MS spectrogram and fragmentation pathway of columbamine

3.3 四氢原小檗碱类生物碱

该类生物碱与原小檗碱类生物碱类似，但无刚性C 环结构，在质谱中易发生RDA 裂解并继续丢失一些取代基，很少存在质荷比高于m/z200 的碎片离子。RDA 裂解产生高峰度的含氮碎片可作为四氢小檗碱型生物碱的特征碎片，特征碎片离子与取代基的位置和类型有关。当在同一环上分别具有2个甲氧基、亚甲二氧基、1 个甲氧基和1 个羟基时，特征碎片离子分别为m/z192、176、178，如四氢巴马汀和黄柏碱。结合碎片离子及文献，共鉴定出四氢原小檗碱类生物碱23 个，分别为化合物9、10、18、21～23、25、30、31、37、38、41、42、44、49、51、53、56、57、65、67、68 和71。

化合物67 为四氢巴马汀，分子式为C21H25NO4，在正离子模式下，准分子离子峰为m/z356.185 6[M＋H]+。四氢巴马汀在同一环上含有2 个甲氧基，会产生峰度较高的特征碎片离子m/z192.101 5 [MC10H12O2]+，在二级质谱中还可以观察到由碎片离子m/z192.1014 5 [M－C10H12O2]+丢失CH3后的碎片离子m/z177.078 1 [M－C10H12O2－CH3]+。其裂解途径见图5。

化合物38 为黄柏碱，分子式为C20H24NO4，在正离子模式下，准分子离子峰为m/z342.169 9 [M]+。黄柏碱在同一环上含有2 个甲氧基，会产生峰度较高的特征碎片离子m/z192.102 5 [M－C9H10O2]+，在二级质谱中还可以观测到由碎片离子m/z192.102 5[M－C9H10O2]+相继失去CH2和CH3的碎片离子m/z178.086 1 [M－C9H10O2－CH2]+和碎片离子m/z163.063 0 [M－C9H10O2－CH2－CH3]+。其裂解途径见图6。

图6 黄柏碱的MS/MS 图与裂解途径Fig. 6 MS/MS spectrogram and fragmentation pathway of phellodendrine

化合物23 和44：化合物23，在正离子模式下，准分子离子峰为m/z342.170 6 [M]+，分子式为C20H24NO4。在二级质谱中，观察到峰度较高的碎片离子m/z192.102 0，表明该化合物在同一环上含有2 个甲氧基，且母核发生了裂解，碎片离子m/z177.085 9 比192.102 0 少15，推断为碎片离子m/z192.102 0 失去了中性碎片CH3。同时，化合物44的二级碎片为342.170 3, 192.102 3, 177.085 7，与化合物23 的二级碎片离子相同，因此推测化合物23和44 为同分异构体，为四氢呋喃非洲防己碱或四氢呋喃药根碱。

3.4 阿朴啡类型生物碱

该类生物碱具有联苯型四环结构，与其他生物碱在结构上存在较大的差异，若结构中存在氮甲基，在质谱中会产生 [M－NH2CH3]+、[M－NH(CH3)2]+等特征碎片离子，同时也会出现CH3、CH4的分子丢失。阿朴啡类生物碱只有侧链的断裂与重组，不会形成m/z较低、丰度较大的碎片离子，如木兰花碱。结合碎片离子及文献，共鉴定出阿朴啡类生物碱9 个，分别为化合物15、28、35、40、50、58、76、88 和89。

化合物28 为木兰花碱，分子式为C20H24NO4，在正离子模式下，准分子离子峰为m/z342.169 9[M]+。木兰花碱中含有NH(CH3)2结构，会产生特征离子碎片m/z297.112 0 [M－NH(CH3)2]+，在二级质谱中，在二级质谱中还可以观察到由碎片离子[M－NH(CH3)2]+相继丢失CH3和OH 产生的碎片离子m/z282.088 9 [M－NH(CH3)2－CH3]+、265.085 5[M－NH(CH3)2－CH3－OH]+，碎片离子m/z265.085 5 在断裂的过程中会发生异构化，继续失去CO 和CH3形成的碎片离子m/z237.091 0 [MNH (CH3)2－CH3－OH－CO]+和m/z222.067 5 [MNH (CH3)2－CH3－OH－CO－CH3]+。其裂解途径见图7。

图7 木兰花碱的MS/MS 谱图与裂解途径Fig. 7 MS/MS spectrogram and fragmentation pathway of magnoflorine

化合物40、50 和76：化合物40，在正离子模式下，准分子离子峰为m/z296.166 4 [M]+，分子式为C19H22NO2。在二级质谱中，观察到特征碎片离子m/z251.108 2 [M－NH(CH3)2]+，碎片离子m/z251.108 2, 236.082 6, 219.079 2, 191.084 5，依次降低15、17、28，推测依次掉落CH3、OH 和CO，与木兰花碱掉落顺序一致。同时，化合物50 和76 碎片离子与化合物40 一致，因此推测化合物40、50 和76 为同分异构体，为annonamine 或其异构体。

3.5 苄基异喹啉类生物碱

该类生物碱易出现氮甲基结构，同样在质谱中会产生 [M－45]+、[M－31]+等特征碎片离子，如果还存在相邻的羟基和甲氧基，则还会失去CH3OH从而形成 [M－45－32]+或 [M－31－32]+的碎片。该类生物碱会发生母核骨架断裂，根据苄基所连接基团的不同，形成m/z107、137、151 特征碎片，如木兰箭毒碱。结合碎片离子及文献，共鉴定出苄基异喹啉类生物碱20 个，分别为化合物4、6、7、8、11、13、14、16、17、19、24、27、33、34、43、45、48、52、69 和72。

化合物11 为木兰箭毒碱，分子式为C19H24NO3，在正离子模式下，准分子离子峰为m/z314.175 1[M]+。在二级质谱中，可以观察到母核断裂后的特征碎片离子m/z107.049 1、151.077 1，掉落氮甲基后的特征碎片离子m/z269.111 6 [M－NH(CH3)2]+，木兰箭毒碱中存在相邻的羟基和甲氧基结构，则还会失去 CH3OH 从而形成m/z237.089 5 [MNH(CH3)2－CH3OH]+。其裂解途径见图8。

图8 木兰箭毒碱的MS/MS 图与裂解途径Fig. 8 MS/MS spectrogram and fragmentation pathway of magnocurarine

化合物34：在正离子模式下，准分子离子峰为m/z330.168 9 [M＋H]+，分子式为C19H23NO4。在二级质谱中，碎片离子m/z192.100 6 为母核断裂所产生，且比母离子峰度高，碎片离子m/z299.127 5 比m/z330.168 9 少了31，是母核发生RDA 裂解丢失NH2CH3所产生，可确定是苄基异喹啉类生物碱。二级质谱得到m/z267.101 0 碎片，推测为化合物34 在丢失NH2CH3的基础上丢失CH3OH 所致，其余碎片离子m/z192.100 6，177.077 7 等推测为该化合物的母核裂解及裂解后丢失CH3产生，结合文献推测该化合物为番荔枝碱[14,19,21-22,25-27]。其裂解途径见图9。

图9 番荔枝碱的MS/MS 图与裂解途径Fig. 9 The MS/MS spectrogram and fragmentation pathway of reticuline

3.6 其他类生物碱

本实验还鉴定出9 个其他类生物碱，分别为化合物1、2、3、20、78、81、84、85 和87。

3.7 宽筋藤生物碱的抗炎活性

3.7.1 宽筋藤生物碱对RAW264.7 细胞活力的影响采用CCK-8 法检测不同浓度宽筋藤生物碱对RAW264.7 细胞活力的影响，结果见表2。在宽筋藤生物碱质量浓度为7.83～500 μg/mL，RAW264.7细胞的存活率高于80%，表明宽筋藤生物碱对RAW264.7 细胞的生长活性没有明显的抑制作用；宽筋藤生物碱在1000 μg/mL 时，对RAW264.7 细胞活力产生显著的抑制作用（P＜0.01）。

表2 不同浓度给药组对 RAW 264.7 细胞活力影响(±s, n = 3)Table 2 Effects of different concentrations of drug groups on the viability of RAW264.7 cells (±s, n = 3)

表2 不同浓度给药组对 RAW 264.7 细胞活力影响(±s, n = 3)Table 2 Effects of different concentrations of drug groups on the viability of RAW264.7 cells (±s, n = 3)

与对照组比较：**P＜0.01**P < 0.001 vs control group

组别 剂量/(μg·mL−1） 细胞存活率/%对照 - 100.00宽筋藤生物碱 1 000.00 26.78±7.46**500.00 81.96±2.98 250.00 88.44±10.48 125.00 96.58±18.04 62.50 96.63±6.04 31.25 94.60±6.83 15.63 97.19±14.71 7.83 95.52±18.43

3.7.2 宽筋藤生物碱对脂多糖诱导的RAW264.7 细胞活力的影响 采用Griess 法测定宽筋藤生物碱对脂多糖诱导的RAW264.7 细胞产生一氧化氮的抑制作用，结果见表3。与模型组比较，宽筋藤生物碱15.63～125.00 μg/mL 对脂多糖诱导RAW264.7 分泌一氧化氮具有明显的抑制作用，抑制率为19.10%～97.01%，并呈现出明显的剂量相关性，其半数抑制浓度为22.87 μg/mL。

表3 不同浓度给药组对脂多糖诱导的RAW264.7 细胞一氧化氮水平影响 (±s, n = 3)Table 3 Effects of different concentrations of drug groups on lipopolysaccharide induced nitric oxide release in RAW264.7 cells (±s, n = 3)

表3 不同浓度给药组对脂多糖诱导的RAW264.7 细胞一氧化氮水平影响 (±s, n = 3)Table 3 Effects of different concentrations of drug groups on lipopolysaccharide induced nitric oxide release in RAW264.7 cells (±s, n = 3)

组别 剂量 一氧化氮抑制率/%对照 - -模型 - -地塞米松 40.00 μmol·L−1 97.28±0.21宽筋藤生物碱 15.63 μg·mL−1 19.10±3.75 31.25 μg·mL−1 54.33±8.36 62.50 μg·mL−1 82.37±4.15 125.00 μg·mL−1 97.01±0.33

4 讨论

近年来，随着人们经济水平的提高，骨质疏松症、关节炎类疾病的发病率呈上升趋势，且发病人群呈年轻化趋势，给患者带来很大的困扰。藏药宽筋藤作为藏医药治疗此类疾病的临床常用药，展现出良好的应用价值。

本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术对其生物碱类成分进行了全面分析。在实验过程中为了获取较好的分离效果，针对有机相：乙腈、甲醇；水相：水、0.1%甲酸水、0.2%甲酸水流动相进行了考察，最终将0.1%甲酸水溶液-乙腈确定为流动相。

基于化合物的结构多样性使得在单一质谱条件下无法获得每个化合物的最优参数，因此，本实验以宽筋藤药材中已知的原小檗碱类生物碱（小檗碱、巴马汀）、四氢原小檗碱类生物碱（四氢巴马汀、黄柏碱）、阿朴啡类生物碱（木兰花碱）和苄基异喹啉类生物碱（木兰箭毒碱）4 种类型生物碱为参照，通过对碰撞能量、碰撞能量范围、离子化温度、气帘气等参数进行优化，获取相应结构的最优碎片离子。同时结合保留时间、相对分子质量、二级质谱的碎片离子、相关文献，共推测鉴定出73 个生物碱，包括12 个原小檗碱型生物碱、23 个四氢原小檗碱型生物碱、20 个苄基异喹啉类生物碱、9 个阿朴啡类生物碱和9 个其他类生物碱。

综上，本研究运用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术对藏药宽筋藤生物碱类成分进行全面系统地解析，为后续的深入研究提供理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突