橘红素2 种脂质纳米粒的制备、表征和口服吸收生物利用度评价

李伟宏，高 娟，王风云*，郑 岩

1. 河南应用技术职业学院，河南 郑州 450042

2. 上海医药工业研究院，上海 201203

橘红素又称桔皮素，属于甲氧基黄酮类化合物，主要存在于柑橘属植物中[1]，具有抗肿瘤、抑制哮喘、抗炎、保护神经、抑制肝肾损伤等活性[2]。橘红素通过抑制Ras/MEK/ERK 信号通路蛋白表达[3]，可有效抑制卵巢癌SKOV3 细胞的增殖与侵袭，并诱导其凋亡。橘红素通过抑制DMBA 诱导的乳腺癌大鼠氧化应激反应[4]，从而对乳腺癌具有明显疗效，可作为治疗乳腺癌候选药物之一，因此橘红素在妇科肿瘤方面具有一定开发价值。橘红素口服剂量达3000 mg/kg 时，14 d 后仍未观察到毒性反应[5]，可见该成分毒性极小，安全性较高。据报道[6]，橘红素油水分配系数（lgP）为3.5，属于生物药剂学分类系统中II 类药物。课题组测得橘红素在25 ℃水中溶解度为（23.25±0.09）μg/mL，极低的溶解度导致溶出速率及溶出度极差，且胃肠道稳定性差[7]，容易发生降解，导致口服绝对生物利用度仅为6.02%[8]。目前，仅见桔皮素自微乳[9]纳米制剂报道，但该制剂中表面活性剂及助表面活性剂用量较高，存在安全隐患，且处方组成复杂。

脂质纳米粒（lipid-based nanoparticles）在提高难溶性药物生物利用度、改善药效等方面获得医药研究者的广泛认可，且生物相容性高，是难溶性药物纳米制剂的优良载体[10]。固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLNs）是采用合成或天然的固态脂质为载体材料，将难溶性药物包裹或分散于其中而制成的一种脂质纳米粒[11-15]，是研究相对较早的一种纳米制剂。纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLCs）系经SLNs 改良而来，通过在载体中引入液态脂质而制备的一种脂质纳米粒[16-19]，属于第2 代脂质纳米粒。为解决橘红素生物利用度低下问题，比较SLNs 和NLCs 在储存稳定性、促吸收作用等方面优劣，本研究在单因素考察的基础上采用Box-Behnken 设计-响应面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）优化橘红素纳米结构脂质载体（tangeretin nanostructured lipid carriers，Tan-NLCs）处方工艺，并制备橘红素固体脂质纳米粒（tangeretin solid lipid nanoparticles，Tan-SLNs），比较Tan-NLCs 和Tan-SLNs 理化性质、体外释药、储存稳定性和口服药动学行为等，为中药难溶性成分脂质纳米粒的选择提供依据，也为橘红素纳米制剂研发提供研究资料。

1 仪器、材料与动物

Master-Sizer 3000 型粒度分析仪，英国马尔文公司；Quintix125D-1CN 型电子分析天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司；1200 型高效液相色谱仪（HPLC），DAD 检测器，美国Agilent 公司；TMX-22R 型高速离心机，美国Beckman 公司；CJB-S-10D型实验室数显恒温磁力搅拌器，郑州特尔仪器设备有限公司；KQ-5200DE 型超声仪，上海科晓科学仪器有限公司；RC-8DS 型溶出试验仪，天津市国铭医药设备有限公司；JEM-2100Plus 型透射电子显微镜（TEM），日本电子株式会社；OLB-WD1000 型氮吹仪，欧莱博科学仪器有限公司；DSC214 Polyma型差示扫描量热仪，德国耐驰仪器公司；D8 Advance型X 射线粉末衍射仪，意大利布鲁克仪器公司。

橘红素原料药，批号20210308，质量分数97.0%，南京广润生物制品有限公司；橘红素对照品，批号201105，质量分数98.8%，大连美仑生物技术有限公司；反式-1,2-二苯乙烯对照品，批号20211208，上海博飞美科化学科技有限公司；单硬脂酸甘油酯（批号 20201014）、乳糖（批号20201011），西安天正药用辅料有限公司；油酸（批号20210120）、泊洛沙姆188（批号20201319），山西锦洋药用辅料有限公司。

18 只健康SD 大鼠，清洁级，雌雄兼用，体质量180～220 g，购自河南省动物实验中心，合格证编号为SCXK（豫）2020-0001。所有动物实验遵循河南应用技术职业学院有关实验动物管理和使用的规定，均符合3R 原则。

2 方法与结果

2.1 Tan-NLCs 及Tan-SLNs 的制备

高压均质法制备Tan-NLCs。精密称取橘红素20 mg、处方量的单硬脂酸甘油酯及油酸，置于圆底烧瓶中，加入20 mL 无水乙醇，置于70 ℃水浴中加热磁力搅拌（850 r/min）至溶解澄清，作为有机相。取一定质量分数泊洛沙姆188 水溶液50 mL 置于70 ℃水浴中，磁力搅拌（850 r/min）至溶解澄清，作为水相。将有机相逐滴加至水相中，磁力搅拌（850 r/min）30 min，立即进行高压均质。置于−10 ℃冰箱中固化10 min，过0.45 μm 水性微孔滤膜，收集续滤液并补加蒸馏水至50 mL，即得Tan-NLCs 混悬液。除不加液态脂质油酸外，同法制备Tan-SLNs。

2.2 HPLC 法测定橘红素含量

2.2.1 测定条件 色谱柱为Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；波长为374 nm；柱温为35 ℃；流动相为甲醇-水（50∶50）；进样量为10 μL；体积流量为1.0 mL/min。

2.2.2 线性关系考察 精密称取20.0 mg 橘红素对照品转移至100 mL 量瓶中，加入甲醇80 mL 超声30 s 溶解，放置10 min 后甲醇稀释定容，得质量浓度为200 μg/mL 橘红素对照品储备液。采用流动相稀释成质量浓度为10.00、5.00、2.50、1.00、0.50、0.05 μg/mL 系列橘红素对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定各个质量浓度（X）的峰面积（Y），以峰面积对质量浓度进行线性回归，得标准曲线回归方程Y＝16.800 4X＋0.152 0，r＝0.999 9，结果表明橘红素在0.05～10.00 μg/mL存在良好的线性关系。

2.2.3 Tan-NLCs 和Tan-SLNs 供试品溶液的制备精密取Tan-NLCs 混悬液1 mL 至50 mL 量瓶中，加入甲醇40 mL 超声5 min（工作2 s，间隔1 s，功率为250 W），甲醇稀释定容。采用0.45 μm 微孔滤膜滤过，精密取续滤液5 mL 至10 mL 量瓶中，加入流动相稀释定容，摇匀即得Tan-NLCs 供试品溶液。同法制备Tan-SLNs 供试品溶液。

2.2.4 专属性考察 取单硬脂酸甘油酯、油酸等辅料按“2.1”项下方法制备空白样品（不含橘红素），按“2.2.3”项方法制备空白样品溶液。取空白样品溶液、橘红素对照品溶液、Tan-NLCs 供试品溶液和Tan-SLNs 供试品溶液分别进样分析，色谱图见图1。表明辅料未干扰橘红素色谱峰，专属性良好，理论塔板数以橘红素计不低于6500。

2.2.5 精密度考察 分别取同1 份Tan-NLCs 和Tan-SLNs 供试品溶液，各6 份，分别按“2.2.1”项下色谱条件测定橘红素峰面积，计算得橘红素峰面积的RSD 分别为1.50%和1.82%，表明精密度良好。

2.2.6 重复性考察 取同1份Tan-NLCs和Tan-SLNs样品，按“2.2.3”项下方法分别平行制备6 份Tan-NLCs 和Tan-SLNs 供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算得橘红素质量浓度的RSD 分别为1.04%和0.86%，结果表明重复性良好。

2.2.7 稳定性考察 取Tan-NLCs 和Tan-SLNs 供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 测定橘红素含量，计算得橘红素峰面积的RSD 分别为0.68%和1.13%，结果表明Tan-NLCs 和Tan-SLNs 供试品溶液稳定性良好。

2.2.8 准确度考察 精密取Tan-NLCs 样品0.5 mL置于50 mL 量瓶中，共9 份，分为低、中、高3 组，每组各3 份。分别加入橘红素对照品储备液（质量浓度为200 μg/mL）0.5 mL（低）、1.0 mL（中）和1.5 mL（高），按“2.2.3”项下方法处理并进样测定橘红素含量，计算得橘红素的平均加样回收率为100.12%，RSD 为1.53%。

Tan-SLNs 样品同法操作，测得计算得平均加样回收率为99.17%，RSD 为0.96%，实验结果表明准确度较高。

2.3 质量指标的测定

精密取Tan-NLCs 混悬液1 mL，置于超滤管中（截留相对分子质量为8000～12 000），12 000 r/min离心（离心机温度为4 ℃，半径为6.4 cm）20 min，取外管液测定游离橘红素质量（m游离）。另精密取Tan-NLCs 混悬液1 mL，按“2.2.3”项下方法操作，测定橘红素总量（m总），计算Tan-NLCs 的包封率和载药量。Tan-SLNs 包封率和载药量同法测定。

m代表药物总量和脂质载体总量

取Tan-NLCs 混悬液，蒸馏水稀释至50 倍，摇匀，取适量于粒度分析仪上测定粒径及ζ 电位。Tan-SLNs 粒径及ζ 电位同法测定。

2.4 Tan-NLCs 处方工艺单因素考察

2.4.1 脂药比的考察 固定桔皮素20 mg，脂质载体为单硬脂酸甘油酯和油酸，固液脂质比为4∶1，泊洛沙姆188 质量分数为1.00%，均质压力为70 MPa，均质次数为8 次的条件下考察脂药比对Tan-NLCs 包封率、载药量和粒径的影响。结果见表1，Tan-NLCs 包封率随着脂药比的增加而增加，载药量随着脂药比的增加呈逐渐下降趋势，可见脂质载体对药物的包载能力是有限的[16]，脂质用量过多时会影响Tan-NLCs 载药量。粒径随着脂药比的增加总体呈增加趋势，可能是由于脂质用量过多时体系黏度较大，导致形成粒径变大。因此脂药比对Tan-NLCs 包封率、载药量和粒径影响较大，需继续进行优化。

表1 脂药比的考察 (±s, n = 3)Table 1 Investigation of lipid-drug ratio (±s, n = 3)

表1 脂药比的考察 (±s, n = 3)Table 1 Investigation of lipid-drug ratio (±s, n = 3)

脂药比 包封率/% 载药量/% 粒径/nm 5∶1 43.62±1.12 6.72±0.14 191.55±13.44 10∶1 58.71±1.62 5.43±0.19 202.78±10.89 15∶1 78.99±0.97 4.94±0.22 190.23±9.62 20∶1 81.12±1.05 3.75±0.15 226.89±10.11 25∶1 81.77±1.32 3.14±0.16 244.40±10.68

2.4.2 固液脂质比的考察 固定桔皮素20 mg，脂药比为15∶1，泊洛沙姆188 质量分数为1.00%，均质压力为70 MPa，均质次数为8 次的条件下考察固液脂质比对Tan-NLCs 包封率、载药量和粒径的影响。结果见表2，不同固液脂质比制得的Tan-NLCs粒径在190～210 nm。Tan-NLCs 的包封率和载药量均随着固液脂质比增加呈先增加后下降情况，表明固液脂质比对Tan-NLCs 的包载药物能力有较大影响[20]，因此需对固液脂质比进行优化。

表2 固液脂质比的考察 (±s, n = 3)Table 2 Investigation of solid-liquid lipid ratio (±s, n = 3)

表2 固液脂质比的考察 (±s, n = 3)Table 2 Investigation of solid-liquid lipid ratio (±s, n = 3)

固液脂质比 包封率/% 载药量/% 粒径/nm 2∶1 34.75±0.89 2.11±0.21 201.17±8.47 3∶1 58.62±1.07 3.64±0.19 206.50±10.26 4∶1 77.84±1.48 4.82±0.23 193.36±9.11 5∶1 74.23±1.52 4.56±0.18 191.48±8.97 6∶1 71.90±1.14 4.30±0.20 204.92±9.25

2.4.3 泊洛沙姆188 质量分数考察 固定桔皮素20 mg，脂药比为15∶1，固液脂质比为4∶1，均质压力为70 MPa，均质次数为8 次条件下考察泊洛沙姆188 质量分数对Tan-NLCs 包封率、载药量和粒径的影响。结果见表3，随着泊洛沙姆188 质量分数的增加Tan-NLCs 包封率和载药量均呈先增加后下降趋势，表明合适的泊洛沙姆188 质量分数利于Tan-NLCs 包载药物。Tan-NLCs 粒径随着泊洛沙姆188质量分数增加而下降，可能是由于泊洛沙姆188 质量分数越大乳化能力越强，越利于形成较小粒径的Tan-NLCs[17]。泊洛沙姆188 质量分数对Tan-NLCs包封率、载药量和粒径影响较大，需继续进行优化。

表3 泊洛沙姆188 质量分数的考察 (±s, n = 3)Table 3 Investigation of poloxamer 188 concentration(±s, n = 3)

表3 泊洛沙姆188 质量分数的考察 (±s, n = 3)Table 3 Investigation of poloxamer 188 concentration(±s, n = 3)

泊洛沙姆188质量分数/% 包封率/% 载药量/% 粒径/nm 0.50 67.94±0.99 4.18±0.22 251.29±12.51 0.75 73.62±1.16 4.56±0.18 234.16±10.69 1.00 79.17±1.10 4.87±0.19 198.35±8.97 1.25 75.89±1.58 4.71±0.24 187.64±8.86 1.50 72.16±1.36 4.43±0.20 180.77±9.02

2.4.4 均质压力的考察 固定桔皮素20 mg，脂药比为15∶1，固液脂质比为4∶1，泊洛沙姆188 质量分数为1.00%，均质次数为8 次的条件下考察均质压力对Tan-NLCs 包封率、载药量和粒径的影响。结果见表4，均质压力大于90 MPa 时Tan-NLCs 包封率和载药量出现下降情况，且粒径变大，可能是均质压力过大时体系温度急剧上升，对Tan-NLCs有破坏作用，导致药物泄露。故选择均质压力为80 MPa 制备Tan-NLCs。

表4 均质压力的考察 (±s, n = 3)Table 4 Investigation of homogeneous pressures (±s,n = 3)

表4 均质压力的考察 (±s, n = 3)Table 4 Investigation of homogeneous pressures (±s,n = 3)

均质压力/MPa 包封率/% 载药量/% 粒径/nm 50 75.13±1.19 4.62±0.23 285.56±20.61 60 77.43±1.60 4.74±0.21 243.91±15.26 70 78.86±1.34 4.76±0.19 203.67±9.63 80 79.07±0.99 4.74±0.24 190.84±8.19 90 75.25±1.08 4.58±0.23 209.45±10.04 100 70.48±1.17 4.31±0.18 218.30±10.99

2.4.5 均质次数的考察 固定桔皮素20 mg，脂药比为15∶1，固液脂质比为4∶1，泊洛沙姆188 质量分数为1.00%，均质压力为80 MPa 条件下考察均质次数对Tan-NLCs 包封率、载药量和粒径的影响。结果见表5，均质次数大于8 次时Tan-NLCs 包封率和载药量均出现下降情况，且粒径变大，可见过多均质可能对Tan-NLCs 产生破坏，由于均质次数为6 次时Tan-NLCs 包封率和载药量相对较大，且粒径小于200 nm，故选择均质6 次来制备Tan-NLCs。

表5 均质次数的考察 (±s, n = 3)Table 5 Investigation of homogeneous times (±s, n = 3)

表5 均质次数的考察 (±s, n = 3)Table 5 Investigation of homogeneous times (±s, n = 3)

均质次数/次 包封率/% 载药量/% 粒径/nm 2 80.94±1.38 5.03±0.21 281.95±19.50 4 80.79±0.94 5.04±0.14 238.23±14.17 6 82.12±1.17 5.10±0.19 192.44±9.28 8 79.66±1.30 4.78±0.16 193.62±8.13 10 74.80±1.45 4.56±0.24 218.79±9.99 12 70.19±1.22 4.39±0.18 240.61±10.23

2.5 BBD-RSM 优化Tan-NLCs 处方

2.5.1 优化方案 根据单因素考察结果，选择脂药比、固液脂质比、泊洛沙姆188 质量分数为主要影响因素，分别作为自变量X1、X2、X3。Tan-NLCs 的包封率、载药量和粒径分别作为因变量Y1、Y2、Y3。采用BBD-RSM 优化Tan-NLCs 处方，各个因素水平见表6。为得到较高的包封率和载药量，且粒径较小的Tan-NLCs 处方工艺，将包封率、载药量和粒径作归一化处理，计算3 者总评归一值（overall desirability，OD）。包封率（d1）和载药量（d2）归一化的计算公式为dmax＝(Mi－Mmin)/(Mmax－Mmin)；粒径（d3）归一化的计算公式为dmin＝(Mmax－Mi)/(Mmax－Mmin)，其中Mi代表该试验组中实际值，Mmax为试验组中最大值，Mmin为试验组中最小值；OD 值计算公式为OD＝(d1d2…dk)1/k。根据试验方案，测得不同Tan-NLCs 处方的包封率、载药量、粒径及OD 值结果见表6。

表6 BBD-RSM 试验设计与结果Table 6 Experiment designs and results of BBD-RSM

2.5.2 模型拟合、分析与最佳处方 使用Design Expert V11.1.2.0 版本对OD 值数据和自变量进行拟合，得二次多元回归方程为OD＝0.870－0.046X1＋0.094X2＋0.087X3－0.230X1X2＋0.120X1X3＋0.037X2X3－0.480X12－0.170X22－0.160X32，模型R2＝0.993 1，Radj2＝0.984 3，两者较为接近且均大于0.98，可见该数学模型对Tan-NLCs 处方研究具有可靠的指导意义。方差分析见表7，数学模型的失拟项P＝0.057 6＞0.05，说明未知因素对模型干扰较小，模型P值＜0.000 1，说明模型具有极显著性意义。模型中X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X12、X22和X32均具极显著差异（P＜0.01）。

表7 方差分析Table 7 Analysis of variance

固定脂药比（X1）、固液脂质比（X2）、泊洛沙姆188 质量分数（X3）中间值不变，绘制自变量与OD 值三维曲面图，结果见图2。设置目标值最小为0，最大为1，得到Tan-NLCs 最佳处方为脂药比为14.47∶1、固液脂质比为4.39∶1、泊洛沙姆188 质量分数为1.06%，预测的Tan-NLCs 的包封率、载药量、粒径和OD 值分别为85.79%、5.54%、178.62 nm 和0.911。

图2 各因素与响应值的三维图Fig. 2 Three-dimensional plots of independent factors and response values

2.6 Tan-NLCs 工艺验证

为便于实际操作，将Tan-NLCs 最佳处方略作调整，即脂药比为14.5∶1、固液脂质比为4.4∶1、泊洛沙姆188 质量分数为1.05%。平行制备3 批Tan-NLCs，分别测定包封率、载药量和粒径，计算Tan-NLCs 各个指标的偏差［偏差＝(实测值－预测值)/预测值］。结果见表8，各个指标相对偏差均小于±5%，证明该数学模型对Tan-NLCs 处方工艺研究具有较强的指导意义。

表8 处方验证结果 (±s, n = 3)Table 8 Validation results of prescription (±s, n = 3)

表8 处方验证结果 (±s, n = 3)Table 8 Validation results of prescription (±s, n = 3)

指标 包封率/% 载药量/% 粒径/nm实测值 85.13±1.01 5.43±0.19 184.77±8.63预测值 85.79 5.54 178.62偏差/% −0.77 −1.98 3.44

2.7 Tan-SLNs 的制备

参考Tan-NLCs 确定的处方工艺，不再加入液态脂质油酸，按“2.1”项下方法制备Tan-SLNs，考察不同脂药比对Tan-SLNs 包封率、载药量和粒径的影响，结果见表9。随着脂药比的增加，Tan-SLNs的包封率逐渐增加，当脂药比大于16.5∶1 后继续增加固体脂质用量，包封率基本不再增加，但载药量下降，且粒径增大，故选择脂药比为16.5∶1 来制备Tan-SLNs。此时Tan-SLNs 包封率、载药量和粒径分别为（73.07±1.38）%、（4.11±0.22）%和（226.09±10.25）nm。

表9 脂药比的考察 (±s, n = 3)Table 9 Investigation of different lipid-drug ratio (±s,n = 3)

表9 脂药比的考察 (±s, n = 3)Table 9 Investigation of different lipid-drug ratio (±s,n = 3)

脂药比 包封率/% 载药量/% 粒径/nm 14∶1 65.53±1.02 4.27±0.14 196.84±10.26 14.5∶1 67.22±1.41 4.24±0.18 203.14±11.10 15∶1 69.58±0.97 4.23±0.13 206.87±12.07 15.5∶1 71.19±1.19 4.28±0.20 212.40±11.26 16∶1 72.02±1.23 4.18±0.19 215.68±9.94 16.5∶1 73.07±1.38 4.11±0.22 226.09±10.25 17∶1 73.22±1.46 4.02±0.17 244.98±12.78 17.5∶1 73.18±0.94 3.93±0.12 269.57±11.33 18∶1 73.26±1.03 3.80±0.23 286.61±13.17

2.8 Tan-NLCs 和Tan-SLNs 的表征

2.8.1 粒径分布和ζ 电位 Tan-NLCs 和Tan-SLNs的粒径分布见图3，Tan-NLCs 粒径分布在100～350 nm，PDI 值为0.095。Tan-SLNs 粒径分布在100～600 nm，PDI 值为0.141，Tan-SLNs 粒径分布范围较宽，PDI 值大于Tan-NLCs。Tan-NLCs 和Tan-SLNs的ζ 电位分别为（−37.84±1.62）mV 和（−38.68±1.57）mV，结果见图4。

图3 Tan-NLCs 和Tan-SLNs 的粒径分布图Fig. 3 Particle size distributions of Tan-NLCs and Tan-SLNs

图4 Tan-NLCs 和Tan-SLNs 的ζ 电位图Fig. 4 ζ potentials of Tan-NLCs and Tan-SLNs

2.8.2 Tan-NLCs和Tan-SLNs的TEM观察 取Tan-NLCs 和Tan-SLNs 混悬液样品，蒸馏水稀释50 倍，滴管吸取适量滴至铜网，1.5%磷钨酸钠染色，置于30 ℃真空干燥箱2 h，于TEM 下观察Tan-NLCs 和Tan-SLNs 的微观形态。结果见图5，Tan-NLCs 和Tan-SLNs 呈椭圆形或球形。

图5 Tan-NLCs (A) 和Tan-SLNs (B) 的TEM 图Fig. 5 TEM of Tan-NLCs (A) and Tan-SLNs (B)

2.9 Tan-NLCs 和Tan-SLNs 冻干粉的制备

精密量取Tan-NLCs 混悬液50 mL，加入质量分数为5%的乳糖，震荡溶解，分装至西林瓶中。置于−45 ℃冰箱中预冻2 d，敞口置于冷阱−35 ℃冷冻干燥机中（真空度0.1 mPa），冷冻干燥2 d，取出即得冻干粉。

Tan-SLNs 冻干粉同法制备，结果见图6。采用蒸馏水复溶Tan-NLCs 冻干粉，测得平均包封率为（80.16±1.43）%，平均粒径为（223.26±9.17）nm，平均ζ 电位为（−31.09±1.15）mV。蒸馏水复溶Tan-SLNs 冻干粉，测得平均包封率为（68.69±1.38）%，平均粒径为（269.28±8.84）nm，平均ζ 电位为（−28.11±1.40）mV。

图6 样品外观Fig. 6 Appearance of samples

2.10 体外释药行为考察

分别取橘红素原料药、Tan-NLCs 冻干粉和Tan-SLNs 冻干粉适量，使橘红素含量均为10 mg，分别加入pH 2.0 磷酸盐缓冲液（PBS）5 mL，转移至活化后透析袋中（截留相对分子质量8000～12 000），扎紧。释放介质为pH 2.0 PBS，介质体积为1000 mL，介质温度为（37±1）℃，溶出仪转速为75 r/min，于0、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、18、24 h 取样5 mL，并补加pH 2.0 PBS 5 mL。12 000 r/min离心（离心机温度为4 ℃，半径为6.4 cm）20 min，取上清液测定橘红素含量。同法测定橘红素原料药、Tan-NLCs 冻干粉和Tan-SLNs 冻干粉在pH 6.8 PBS中释药情况，结果见图7。Tan-NLCs 冻干粉和Tan-SLNs 冻干粉均可增加橘红素释放速率和累积释放度，且Tan-SLNs 冻干粉释药速率和累积释放度均高于Tan-NLCs 冻干粉。2 种脂质纳米粒释药模型拟合结果见表10，均符合Weibull 模型，呈双相动力学特征[21-22]。

图7 pH 2.0 PBS 和pH 6.8 PBS 中体外释药结果 (±s, n = 6)Fig. 7 In vitro release curves in pH 2.0 PBS and pH 6.8 PBS (±s, n = 6)

表10 Weibull 释药模型和相关系数Table 10 Weibull release model and coefficient

2.11 示差量热扫描（ differential scanning calorimetry，DSC）法分析研究

取橘红素原料药、空白辅料、物理混合物（原料药和辅料比例与Tan-NLCs 冻干粉一致）、Tan-NLCs 冻干粉和Tan-SLNs 冻干粉适量置于样品槽，压制后进行DSC 分析，分析条件：Al2O3为参比物，升温范围为30～300 ℃，升温速度为10 ℃/min。结果见图8，橘红素原料药在154.5 ℃出现熔点峰，可能由于单硬脂酸甘油酯和油酸等脂质辅料熔点较低，随着仪器逐渐升温脂质先行溶解，进而对橘红素熔点产生影响，导致物理混合物中橘红素熔点峰提前至136.7 ℃。Tan-NLCs 冻干粉和Tan-SLNs 冻干粉DSC 图谱仅可观察到空白辅料的DSC 图谱，而橘红素熔点峰消失，证明橘红素在Tan-NLCs 冻干粉和Tan-SLNs 冻干粉中物相发生变化。

图8 DSC 结果Fig. 8 Results of DSC

2.12 X 射线粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRPD）法分析

取橘红素原料药、乳糖、空白辅料、物理混合物（原料药和辅料比例与Tan-NLCs 冻干粉一致）、Tan-NLCs 冻干粉和Tan-SLNs 冻干粉适量置于样品槽中进行XRPD 扫描，结果见图9。橘红素原料药在8.1°、9.5°、12.2°、14.5°、18.7°、24.1°、27.6°、29.4°等处出现特征晶型峰。由于辅料的掩蔽作用在物理混合物XRPD图谱中仍可见橘红素在9.5°、14.5°和29.7°处的特征晶型峰。Tan-NLCs 冻干粉和Tan-SLNs 冻干粉XRPD 图谱中橘红素晶型峰消失，说明橘红素在Tan-NLCs 冻干粉和Tan-SLNs 冻干粉中可能以无定形形式存在。

图9 XRPD 结果Fig. 9 Results of XRPD

2.13 Tan-NLCs 冻干粉和Tan-SLNs 冻干粉稳定性研究

取Tan-NLCs 冻干粉和Tan-SLNs 冻干粉密封于西林瓶中，置于温度30 ℃、湿度60%恒温恒湿箱中，90 d 后取样复溶后测定包封率、粒径、ζ 电位。结果见表11，Tan-SLNs 冻干粉放置90 d 后包封率大幅度下降，粒径增大，ζ 电位绝对值变小。Tan-NLCs 冻干粉包封率、粒径和ζ 电位绝对值与新制备Tan-NLCs 冻干粉相比均未出现明显变化，可见Tan-NLCs 冻干粉稳定性高于Tan-SLNs 冻干粉。

表11 稳定性结果 (±s, n = 3)Table 11 Stability results (±s, n = 3)

表11 稳定性结果 (±s, n = 3)Table 11 Stability results (±s, n = 3)

样品 包封率/% 粒径/nm ζ 电位/mV Tan-SLNs 冻干粉 54.16±1.69 492.83±58.71 −17.44±1.30 Tan-NLCs 冻干粉 80.20±1.35 230.79±13.45 −30.26±1.52

2.14 口服药动学研究

2.14.1 实验方案 取橘红素原料药、Tan-NLCs 冻干粉和Tan-SLNs 冻干粉，加入0.5%的CMC-Na 溶液配制ig 液，临用现配。取禁食过夜的SD 大鼠18只，随机分成3 组，分别称量体质量，按50 mg/kg ig 给药后立即计时。于0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12 h 将待取血大鼠用乙醚麻醉，立即于眼眶后静脉丛取血约0.25 mL，玻璃毛细管引流至含肝素离心管中，涡旋5 s 混匀，3000 r/min 离心2 min，取上层血浆冷冻保存。

2.14.2 血浆样品的处理[8]采用甲醇稀释配制质量浓度为2000 ng/mL 反式-1,2-二苯乙烯对照品，作为药动学研究用内标溶液。精密取血浆样品100 μL和50 μL 内标溶液离心管中，加入0.5 mL 乙腈，涡旋混合30 s，静置10 min，8000 r/min 离心（半径为6.4 cm）20 min。取上清液至另一离心管中，置于45 ℃水浴中氮气吹干，加入100 μL 乙腈复溶，8000 r/min 离心（半径为6.4 cm）5 min，取上清液进样测定。

2.14.3 线性关系考察 血药浓度测定色谱条件同“2.2.1”项下。取质量浓度为5 μg/mL 橘红素对照品溶液，甲醇稀释成质量浓度为2000、1000、500、250、100、50 ng/mL 一系列对照品溶液，分别取100 μL 至另一离心管中，置于45 ℃水浴中氮气吹干，加入100 μL 空白血浆涡旋混合30 s，按“2.14.2”项下操作并测定。橘红素质量浓度为横坐标（X），橘红素与反式-1,2-二苯乙烯峰面积比为纵坐标（Y）进行回归，得回归方程Y＝0.002 2X＋0.250 4，r＝0.997 2，结果表明橘红素血浆对照品溶液在50～2000 ng/mL 存在线性关系。

2.14.4 专属性考察 取空白血浆、血浆对照品溶液（橘红素质量浓度100 ng/mL）、血浆样品（Tan-SLNs冻干粉ig 5 h），按“2.2.1”项下色谱条件进样分析。色谱图见图10，表明血浆内源性物质未对橘红素和反式-1,2-二苯乙烯产生干扰，专属性高。

图10 空白血浆 (A)、血浆对照品溶液 (B) 和血浆样品(C) 的HPLC 图Fig. 10 HPLC of blank plasma (A), plasma reference solution (B), plasma sample (C)

2.14.5 稳定性考察 取橘红素原料药ig 2 h 的血浆样品，于处理后0、3、6、9、12、18 h 进样测定，计算得橘红素与反式-1,2-二苯乙烯峰面积比的RSD为5.66%，表明血浆样品溶液稳定性良好。

2.14.6 精密度考察 取低、中、高质量浓度（50、1000、2000 ng/mL）橘红素血浆对照品溶液，同1 d连续测定6 次，计算得橘红素与内标面积比的RSD分别为7.11%、4.86%、5.29%，结果表明日内精密度良好；低、中、高质量浓度橘红素血浆对照品溶液连续测定6 d，每天测试1 次，计算得橘红素与反式-1,2-二苯乙烯峰面积比的RSD 分别为8.90%、6.28%、4.88%，表明日间精密度良好。

2.14.7 重复性考察 取Tan-SLNs ig 1 h 血浆样品，按“2.14.2”项下方法平行制备6 份血浆样品溶液，进样测定，计算得橘红素与内标面积比的RSD 分别为4.16%，结果表明该法重复性良好。

2.14.8 加样回收率考察 取空白血浆配制橘红素质量浓度分别为50、1000、2000 ng/mL 血浆样品，各平行3 份，按“2.14.2”项下方法操作制备血浆样品溶液，测定橘红素与反式-1,2-二苯乙烯峰面积，带入血浆对照品标准曲线计算橘红素测得质量浓度，并与实际配制质量浓度相比计算加样回收率。结果显示平均加样回收率为96.10%，RSD为6.23%，表明准确度较高。

2.14.9 定量限和检测限考察 取橘红素质量浓度为50 ng/mL 的血浆样品（不含反式-1,2-二苯乙烯），逐步稀释并测定，结果显示定量限和检测限分别为10 ng/mL 和5 ng/mL。

2.14.10 药动学结果 橘红素原料药、Tan-NLCs 冻干粉和Tan-SLNs 冻干粉的药-时曲线见图11。DAS 3.0 软件非房室模型计算主要药动学参数，结果见表12。与橘红素原料药相比，Tan-SLNs 的tmax、t1/2、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞均有显著性改变（P＜0.05、0.01），其中tmax延后至（3.12±0.55）h，t1/2延长至（5.14±0.73）h，Cmax和相对口服吸收生物利用度分别提高至2.01 倍和3.10 倍。Tan-NLCs 的tmax、t1/2、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞也均有显著性改变（P＜0.05、0.01），其中tmax延后至（3.17±0.64）h，t1/2延长至（5.10±0.81）h，Cmax和相对口服吸收生物利用度分别提高至2.83 倍和4.59 倍，可见Tan-SLNs 和Tan-NLCs 可促进橘红素口服吸收。与Tan-SLNs 相比，Tan-NLCs 的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞有显著性增加（P＜0.05），因此Tan-NLCs 促吸收作用优于Tan-SLNs。

图11 药-时曲线 (±s, n = 6)Fig. 11 Drug concentration-time curves (±s, n = 3)

表12 主要药动学参数 (±s, n = 6)Table 12 Main pharmacokinetic parameters (±s, n = 6)

表12 主要药动学参数 (±s, n = 6)Table 12 Main pharmacokinetic parameters (±s, n = 6)

与橘红素比较：*P＜0.05**P＜0.01；与Tan-SLNs 比较：#P＜0.05*P < 0.05**P < 0.01 vs tangeretin;#P < 0.05 vs Tan-SLNs

参数 单位 橘红素 Tan-SLNs Tan-NLCs tmax h 1.96±0.33 3.12±0.55* 3.17±0.64*t1/2 h 3.90±0.66 5.14±0.73* 5.10±0.81*Cmax ng∙mL−1 603.72±114.68 1 214.08±352.13** 1 710.79±403.11**#AUC0～t ng∙h∙mL−1 1 748.64±375.97 5 422.12±486.94** 8 021.30±1 178.56**#AUC0～∞ ng∙h∙mL−1 1 907.36±401.85 5 608.75±541.76** 8 211.92±1 273.78**#

3 讨论

Tan-NLCs 包封率和载药量高于Tan-SLNs，可能是由于在固态脂质中引入液态脂质后形成空间结构缺陷，有利于包载更多药物；药物在液态脂质中溶解度往往较高，从而使更多药物被包载进入Tan-NLCs。2 种脂质纳米粒在pH 2.0 PBS 和pH 6.8 PBS中释药结果显示，Tan-SLNs 释药速率和累积释放度均高于Tan-NLCs，可能是由于Tan-SLNs 中药物在分布在表层或浅表层，释药阻力相对较小。Tan-NLCs 处方中引入液态脂质后影响了药物分布[10]，使药物更易聚集于Tan-NLCs 内部，因而释药阻力大于Tan-SLNs，最终使Tan-NLCs 释药速率和累积释放度均低于Tan-SLNs，缓释特征更为明显。

Tan-SLNs平均粒径和PDI值均大于Tan-NLCs，可能与体系黏度相关[23]。体系黏度越小形成脂质纳米粒的粒径也越小，由于Tan-NLCs 处方中引入液态脂质后体系黏度及表面张力均随之下降，故更易形成粒径较小的Tan-NLCs，且粒径分布更窄。Tan-SLNs 和Tan-NLCs 冻干粉的XRPD 和DSC 研究结果表明，橘红素在Tan-SLNs 和Tan-NLCs 冻干粉可能以无定型形式存在，放置90 d 后，Tan-SLNs 冻干粉包封率下降、粒径增大、ζ 电位绝对值变小，可见Tan-SLNs 冻干粉储存稳定性存在一定问题。Tan-NLCs 冻干粉放置90 d 后包封率、粒径和ζ 电位与新制备的Tan-NLCs 冻干粉相比基本无变化，说明Tan-NLCs 冻干粉储存稳定性高于Tan-SLNs 冻干粉。可能是由于Tan-NLCs 处方中引入液态脂质后可有效避免药物被排挤出固态脂质晶格[10]，提高储存稳定性。

Tan-SLNs 和Tan-NLCs 的tmax均发生显著性延后，可能是由于Tan-SLNs 和Tan-NLCs 缓释作用，从而影响了药物进入血液循环速度所致[24-25]。Tan-SLNs 和Tan-NLCs 的t1/2均显著性延长，可能是由于部分Tan-SLNs 和Tan-NLCs 以整体形式进入血液循环[17]，从而使t1/2延长，利于增加药物体循环时间及吸收程度。

Tan-SLNs 和Tan-NLCs 的Cmax和相对口服吸收生物利用度显著性增加，可能与桔皮素溶解度及溶出度增加有关，解决了吸收瓶颈；橘红素在Tan-SLNs 和Tan-NLCs 中以无定型形式存在，无定型药物比结晶型药物更易吸收；Tan-SLNs 和Tan-NLCs的包裹作用增加了橘红素稳定性，使之免受胃肠道各种酶、pH 值影响，增加了进入血液循环的量[21]；橘红素比表面积激增，利于与胃肠道充分接触，促进了药物吸收。Tan-NLCs 促吸收作用高于Tan-SLNs，可能是由于Tan-NLCs 稳定性高于Tan-SLNs；Tan-NLCs 粒径小于Tan-SLNs，更易发挥纳米制剂特殊的吸收机制[20]；处方中液态油脂对药物具有更大的增溶能力，且液态油脂本身具有增加药物透膜渗透作用[26-27]。

综上，本实验成功制备了Tan- SLNs 和Tan-NLCs 冻干粉，橘红素溶出度及生物利用度得到明显改善，但Tan-NLCs 冻干粉储存稳定性高于Tan-SLNs 冻干粉，促吸收效果更大，后续将对Tan-NLCs冻干粉药效学展开评价，进一步丰富研究资料。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突