基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路研究乌梅丸对溃疡性结肠炎小鼠结肠上皮细胞焦亡的作用机制

赵冠宇，辛蕊华，仇正英，石 磊，王瑞琼,2，邵 晶,2，吴国泰,2*，杜丽东,2*

1. 甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000

2. 陇药产业创新研究院，甘肃 兰州 730000

3. 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州 730050

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种由过度炎症反应引起的非特异性肠病，已被世界卫生组织定义为难治性疾病。主要表现为从直肠开始出现溃烂并最终延伸至结肠近端，且伴有腹痛的血性腹泻。近年来，UC 的发病率在全球范围内逐年递增，在亚洲地区尤为明显[1-2]。UC 患者的正常生活受到严重影响，更令人担忧的是UC 病程长且易反复发作，患者肠道癌变的风险远高于正常人[3-4]。目前，UC 发病机制尚未完全揭示，临床治疗药物中5-氨基水杨酸类药物（5-amino salicylic acid，5-ASA）应用最广、治疗效果较好，但长期应用存在一定的不良反应。因此对新型治疗药物的需求与日俱增。

传统中医药理论将UC 定义为湿热蕴肠、肝脾虚弱、外邪入体导致出血性腹泻，中药的多靶点、低毒性的特点为破解UC 反复发作的治疗困境提供可能。乌梅丸是出自东汉张仲景《伤寒论》的经典方剂，由乌梅、花椒、细辛、干姜、黄连等10 味药物组成，有缓肝调中、清上温下之效，用于治疗蛔厥久痢，距今已有近2000 年的用药历史[5]。现今，乌梅丸用于治疗多种胃肠疾病[6]。课题组前期研究发现乌梅丸对UC 有一定治疗作用，但其对结肠上皮细胞焦亡的影响尚不清楚。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）是NOD 样受体家族（NOD-like receptors，NLRs）的重要成员，是先天免疫的核心之一。活化的NLRP3 炎症小体通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteinasparate protease-1，Caspase-1），促进细胞内白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-1β 前体的活化，激活消皮素D（gasdermin D，GSDMD）触发细胞焦亡[7]。研究发现，NLRP3 在UC 患者及不同方式诱导的UC 动物模型中均异常表达。王康等[8]通过体外研究发现葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt，DSS）诱导24 h 后，人结直肠腺癌Caco-2 细胞和人正常结肠上皮NCM460 细胞的细胞膜完整性被破坏，细胞损伤明显，细胞焦亡诱导蛋白GSDMD-N 的表达显著升高，提示DSS 能够诱导上皮细胞过量焦亡，破坏肠黏膜屏障诱发UC。本研究使用2% DSS 诱导建立UC 小鼠模型，ig 乌梅丸水煎液进行干预，通过药效指标和NLRP3/Caspase-1/GSDMD 通路相关蛋白检测，研究乌梅丸上皮细胞焦亡的影响，为乌梅丸治疗UC 的推广应用提供依据。

1 材料

1.1 动物

SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠，6～7 周龄，购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，许可证号SYXK（甘）2019-0002。动物于室温（25.0±0.5）℃、相对湿度（55±5）%、自然光照/黑暗循环的环境下饲养。动物实验由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所实验动物伦理委员会批准（2022-009）并在其指南下进行。

1.2 药材

乌梅丸（乌梅30 g、当归6 g、桂枝6 g、人参6 g、干姜9 g、制附子6 g、花椒5 g、细辛3 g、黄连9 g、黄柏6 g）按照《方剂学》组方，中药饮片均购自甘肃中医药大学附属医院，经甘肃中医药大学附属医院杨锡仓主任中药师分别鉴定为蔷薇科植物梅Prunusmume(Sieb.) Sieb. et Zucc.的干燥近成熟果实、伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels 的干燥根、樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl 的干燥嫩枝、五加科植物人参PanaxginsengC.A. Mey.的干燥根和根茎、姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根茎、毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品、芸香科植物花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim.的干燥成熟果实、 马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoidesFr. Schmidt var.mandshuricum(Maxim.) Kitag.的干燥根和根茎、毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.的干燥根茎、芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮。

1.3 药品与试剂

美沙拉嗪（批号GC16607）购自美国GLP BIO公司；DSS（批号S2839，相对分子质量36 000～50 000）购自美国MP 公司；Occludin-1 兔多克隆抗体（批号66378-1-ig）购自美国Proteintech 公司；NLRP3 抗体（批号13158S）、Caspase-1 抗体（批号89332S）、GSDMD-N 抗体（批号10137S）、β-actin抗体（批号4970S）均购自美国CST 公司；山羊抗兔IgG 二抗（批号BF03008）、山羊抗鼠IgG 二抗（批号BF03001）均购自北京博奥龙免疫技术有限公司；小鼠IL-18 ELISA 试剂盒（批号JL20253）、IL-1β ELISA 试剂盒（批号JL18442）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、ELISA 试剂盒（批号JL11855）均购自上海江莱生物公司；TUNEL 染色试剂盒（批号11684795910）购自瑞士罗氏公司。

1.4 仪器

CX-23 型光学显微镜（日本Olympus 公司）；ASP300S 型组织脱水机、RM2016 型石蜡切片机（德国Leica 公司）；Bead Ruptor 12 型组织研磨机（美国Omni International 公司）；5418R 型低温离心机、BioPhotometer plu/D30 型核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf 公司）；Gen5 型多功能酶标仪（美国Bio-Tek 公司）；ProFlex 3×32 型荧光定量PCR 仪（购自美国Thermo Fisher Scientific 公司）；Quant Studio 5 型qRT-PCR 仪（美国ABI 公司）；PowerPac HC型电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；DYCZ-40S 型转膜槽（北京六一生物技术有限公司）。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 乌梅丸给药溶液的制备 乌梅丸全方用10倍量水浸泡30 min（制附子先煎30 min，人参隔水蒸30 min）后煎煮，武火煮沸后转文火煎煮45 min，趁热滤过。剩余药渣再加入8 倍量水重复煎煮45 min，合并2 次药液。浓缩后得到含生药量1.3 g/mL药液。经HPLC 检测乌梅丸水煎液中盐酸黄柏碱质量分数为0.18 mg/g、盐酸黄连碱质量分数为1.72 mg/g、盐酸小檗碱质量分数为4.84 mg/g，均符合《中国药典》2020 年版一部中乌梅丸含量检测标准。

2.1.2 美沙拉嗪给药溶液的制备 称取0.625 g 美沙拉嗪溶于25 mL 5%羧甲基纤维素钠中，配制成25 mg/mL 的美沙拉嗪溶液。

2.1.3 2% DSS 溶液的制备 称取2 g DSS 溶于水，并加水至100 mL 配制成2% DSS 溶液，于4 ℃冰箱保存待用。

2.2 动物分组、造模与给药

小鼠适应性饲养7 d 后，按照随机数字表法将30 只小鼠分为对照组、模型组、美沙拉嗪（0.5 g/kg）组和乌梅丸低、高剂量（13.04、26.09 g/kg，分别相当于临床剂量的1、2 倍）组，每组6 只。对照组小鼠自由饮水，其余各组自由饮用2% DSS 溶液复制UC 小鼠模型，同时各给药组ig 相应药物，1 次/d，连续7 d。末次给药后，所有动物禁食不禁水24 h，异氟烷吸入麻醉，摘眼球取血，脱颈椎处死小鼠，取完整结肠测量长度并拍照，同时取结肠后段2～3 cm 处剖开拍照，剩余结肠分段保存于4%多聚甲醛和−80 ℃冰箱待用。

2.3 疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分

每天称定小鼠体质量，观察粪便和便血情况。参照Zhou 等[9]方法进行DAI 评分。

2.4 结肠长度测量及结肠黏膜损伤指数（colon mucosa damage index，CMDI）评分

取各组小鼠完整结肠，测量并记录结肠长度。取2～3 cm 结肠段沿肠系膜纵向剖开，生理盐水冲去结肠内粪便，观察结肠表面损伤情况。参考Cheng等[10]方法进行CMDI 评分。

2.5 组织学评价

取4%多聚甲醛固定的结肠组织，脱水后石蜡包埋，切成5 μm 薄片，进行苏木素-伊红（HE）染色。于光学显微镜下观察组织形态并参照Almarzooqi 等[11]评分方法进行组织病理学评分。

2.6 TUNEL 染色

取“2.5”项下组织石蜡块，按5 μm 连续切片，按TUNEL 染色试剂盒说明书染色后，于荧光显微镜下观察并拍照。

2.7 qRT-PCR 检测结肠组织Occludin-1、IL-18、IL-1β、NLRP3、GSDMD 和Caspase-1 mRNA 表达

取−80 ℃冰箱保存的结肠组织，用TRIZOL 提取组织中总RNA。按照试剂盒说明书合成cDNA，进行qRT-PCR 分析。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 个循环。使用2−∆∆Ct计算目的基因相对表达量，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.8 Western blotting 检测Occludin-1、NLRP3、GSDMD-N 和Caspase-1 蛋白表达

取−80 ℃保存的结肠组织，加入800 μL 预冷的蛋白提取混合液（RIRP 缓冲液-蛋白酶抑制剂-磷酸酶抑制剂100∶1∶1）及研磨珠4～5 粒，组织研磨机研磨20 s，制备组织匀浆。4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，取上清液。采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度后，加入PBS 及Loading Buffer 于100 ℃金属浴中进行蛋白变性10 min。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭后，加入一抗孵育过夜，隔天加入二抗孵育1 h，滴加ECL 发光液，暗室内曝光，扫描显影条带，采用Image J 软件分析目的蛋白的灰度值并进行统计分析。

2.9 ELISA 检测外周血DAO 活性和IL-18、IL-1β含量

取各组小鼠血液，4 ℃、3500 r/min 离心15 min，吸取上层血清，按照ELISA 试剂盒说明书检测血清DAO 活性和IL-18、IL-1β 含量。

2.10 统计学分析

用GraphPad Prism 9软件作图，用Image J及Imagepro plus 6.0 软件对HE 染色、TUNEL 染色、Western blotting 图片进行处理。用IBM SPSS 27 软件通过独立样本T检验进行显著性统计，数据表示为±s。

3 结果

3.1 乌梅丸对UC 小鼠一般状态和DAI 评分的影响

与对照组比较，模型组小鼠造模第3 天起出现倦怠、扎堆、肛门附近毛发杂乱等变化，4～7 d 出现逐渐加重的便血现象，2 d 后体质量下降逐渐加剧，并于第5 天起具有显著性差异（P＜0.05、0.01，图1）；同时DAI 评分升高，并于第3 天起具有显著性差异（P＜0.01）。与模型组比较，美沙拉嗪和乌梅丸能显著减轻小鼠体质量下降（P＜0.05、0.01），延缓DSS 导致的小鼠便血，减轻便血症状，显著降低小鼠DAI 评分（P＜0.05、0.01）。

图1 乌梅丸对UC 小鼠体质量和DAI 评分的影响 (±s, n = 6)Fig. 1 Effect of Wumei Wan on body weight and DAI score of UC mice (±s, n = 6)

3.2 乌梅丸对UC 小鼠结肠长度和CMDI 评分的影响

如图2 所示，与对照组比较，模型组小鼠结肠长度显著缩短（P＜0.01），CMDI 评分显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，美沙拉嗪组和乌梅丸高剂量组小鼠结肠长度显著增加（P＜0.01），各给药组CMDI 评分显著降低（P＜0.05、0.01）。

图2 乌梅丸对UC 小鼠结肠长度和CMDI 评分的影响 (±s, n = 6)Fig. 2 Effect of Wumei Wan on colonic length and CMDI scores of UC mice (±s, n = 6)

3.3 乌梅丸对UC 小鼠结肠组织病理变化的影响

如图3 所示，对照组小鼠结肠中未见明显炎症细胞浸润，绒毛和隐窝结构良好，上皮细胞层完整，黏膜下层未见明显水肿。与对照组比较，模型组小鼠结肠黏膜下层出现明显的炎症细胞浸润，黏膜下层间隙增大，隐窝结构损伤，肠上皮细胞损伤，病理组织学评分显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，乌梅丸高剂量组炎症细胞浸润面积降低，黏膜下层水肿缓解，绒毛和隐窝结构完整，上皮细胞层损伤修复，病理组织学评分显著降低（P＜0.01），作用优于低剂量组。

图3 乌梅丸对UC 小鼠结肠组织病理变化的影响 (±s, n = 3)Fig. 3 Effect of Wumei Wan on pathological changes of colon tissue in UC mice (±s, n = 3)

3.4 乌梅丸对UC 小鼠肠黏膜通透性的影响

如图4 所示，与对照组比较，模型组小鼠外周血DAO 活性显著升高（P＜0.01），结肠组织Occludin-1 蛋白和mRNA 表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠外周血DAO活性均显著下降（P＜0.01），结肠组织Occludin-1mRNA 表达水平均显著升高（P＜0.01），美沙拉嗪组和乌梅丸高剂量组结肠组织Occludin-1 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01），提示乌梅丸能修复肠黏膜屏障，降低肠黏膜通透性。

图4 乌梅丸对UC 小鼠外周血DAO 活性 (A)、结肠组织Occludin-1 mRNA (B) 和蛋白 (C) 表达的影响 (±s, n = 3)Fig. 4 Effect of Wumei Wan on DAO activity (A) in peripheral blood, Occludin-1 mRNA (B) and protein (C) expressions in colon tissue of UC mice (±s, n = 3)

3.5 乌梅丸对UC 小鼠肠上皮细胞的保护作用

如图5 所示，与对照组比较，模型组小鼠结肠组织中受损死亡的细胞数量增加，死亡细胞比例显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组结肠组织中细胞死亡数量减少，死亡细胞比例显著降低（P＜0.05、0.01），且乌梅丸高剂量组作用优于低剂量组。

图5 乌梅丸对UC 小鼠肠上皮细胞的保护作用 (±s, n = 3)Fig. 5 Protective effect of Wumei Wan on intestinal epithelial cells in UC mice (±s, n = 3)

3.6 乌梅丸对UC 小鼠结肠上皮细胞焦亡关键炎症因子的影响

如图6 所示，与对照组比较，模型组小鼠外周血IL-18、IL-1β 含量显著升高（P＜0.01），结肠组织IL-18、IL-1βmRNA 表达水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组外周血IL-18、IL-1β 含量和结肠组织IL-18、IL-1βmRNA 表达水平均显著降低（P＜0.05、0.01）。

图6 乌梅丸对UC 小鼠外周血IL-1β、IL-18 含量 (A) 和结肠组织IL-1β、IL-18 mRNA 表达 (B) 的影响 (±s, n = 3)Fig. 6 Effect of Wumei Wan on IL-1β, IL-18 levels in peripheral blood (A) and IL-1β, IL-18 mRNA expressions in colon tissue(B) of UC mice (±s, n = 3)

3.7 乌梅丸对UC 小鼠结肠组织NLRP3/Caspase-1/GSDMD 焦亡通路的影响

如图7 所示，与对照组比较，模型组小鼠结肠组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD的mRNA 和蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠结肠组织NLRP3、Caspase-1、GSDMDmRNA 表达水平显著下降（P＜0.01），Caspase-1 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），美沙拉嗪组和乌梅丸高剂量组NLRP3 和GSDMD-N 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01），提示乌梅丸能够抑制DSS诱导NLRP3/Caspase-1/GSDMD 通路的过度活化进而抑制细胞焦亡的发生。

图7 乌梅丸对UC 小鼠结肠组织NLRP3/Caspase-1/GSDMD 焦亡通路的影响 (, n = 3)Fig. 7 Effect of Wumei Wan on NLRP3/Caspase-1/GSDMD pyroptosis pathway in colon tissue of UC mice (±s, n = 3)

4 讨论

UC 发病率的全球性升高带来的医疗压力已经引起广泛关注，尚未明确的复杂发病机制为UC 的治疗带来了重大阻碍。美沙拉嗪作为临床最常用治疗药物，使用频率逐年增加，同时暴露出一定的使用限制[12-13]。传统中草药成为UC 治疗的新选择，其中乌梅丸等中药方剂在治疗UC 上被寄予厚望[14-15]。乌梅丸出自张仲景所著的《伤寒论》，有温上清下、安蛔止痛之效[16]，对治疗肠道疾病，尤其对炎症性肠病有显著疗效[17]。核因子-κB、Notch 等通路已被研究证实是乌梅丸治疗UC 的作用靶点，充分展现了中药多靶点治疗的优势[18-19]。本研究在已有研究的基础上，构建UC 小鼠模型并ig 乌梅丸水煎液，发现乌梅丸能缓解DSS 诱导的小鼠体质量下降、便血、结肠缩短等症状，修复肠道黏膜屏障的病理损伤，对UC 有治疗作用。

肠黏膜屏障具有维护肠道稳态，控制肠内外物质交换的功能。肠上皮细胞和细胞间连接构成的完整结构是维持屏障功能的重要保证[20]。黏膜通透性的增加是UC 发病的关键机制之一，促进肠道修复、恢复肠黏膜通透性被认为是UC 治愈中的关键[21-22]。本研究发现乌梅丸组小鼠血清DAO 活性显著减少，结肠组织中Occludin-1 蛋白和mRNA 表达水平显著回升，提示乌梅丸通过促进紧密连接表达，促进肠黏膜屏障修复。HE 和TUNEL 染色发现，模型组小鼠肠道中肿胀破裂的上皮细胞比例增加，死亡的细胞出现脱离现象，而乌梅丸能减少结肠上皮细胞死亡，维持上皮屏障结构完整性，这一发现证明了上皮细胞在肠黏膜屏障的重要作用，为UC 的相关研究提供了新的切入点。

上皮细胞的增殖分化、衰老以及损伤细胞的脱落共同维持肠道上皮屏障的稳定，保证肠道功能的同时维持肠道细胞活力[23]。Yan 等[24-25]研究发现，乌梅丸能够通过调节巨噬细胞极化、维持上皮细胞增殖和凋亡间的平衡等机制缓解UC。细胞焦亡是一种较为独特的细胞程序性死亡的方式，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，并伴随细胞内炎症因子的释放，能够进一步加剧炎症反应。上皮细胞过度焦亡造成上皮细胞层损伤，同时加剧肠道内的炎症反应，进而导致UC 的加剧[26]。本研究通过检测血清和组织中参与细胞焦亡的炎症因子IL-1β、IL-18 的表达，以及结肠中关键因子NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白和mRNA 表达，减少上皮细胞焦亡比例。

本研究结果表明，乌梅丸能够减轻由DSS 诱导的小鼠肠道黏膜病理损伤、逆转便血及体质量降低等病理现象，其作用机制可能是通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD 信号通路发挥修复肠道上皮屏障、缓解肠道炎症损伤的作用。本研究结果为乌梅丸作为UC 的临床有效治疗药物提供理论基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突