微波消解-原子荧光法检测液奶中砷和汞样品前处理方法探究及应用

毕成名，卢智华，李艳红*，齐 琦，秦晓婷，王英南，李洪梅，王 斌，白晓玲，伊德润

1 蒙牛乳业（唐山）有限责任公司，河北唐山 064000

2 蒙牛乳业常温事业部，内蒙古呼和浩特 011500

0 引言

牛奶含有丰富的维生素、蛋白质、脂肪等营养物质，具有极高的营养价值，是人类重要的营养物质来源之一[1]。近年来更为严峻的环境污染，饮水和土壤中重金属元素含量不断提高[2]，环境中的金属元素在食物链中不断积累，牛奶受重金属元素污染的风险急剧增加。人们长期食用被重金属元素污染的牛奶，在体内富集到一定的程度，对人体器官造成不可逆转的伤害[3]。重金属元素汞在人体体内不断积累会损害人的神经系统，引起听觉和语言功能障碍[4]；重金属元素砷在体内积累较多时会造成人体的急、慢性中毒，还可能会造成体内多种酶和基因产生影响，进而影响体内代谢，增加患多种疾病的风险[5]。因此，开发一种大规模灵敏检测牛奶中重金属元素的方法特别重要[6]。

牛奶中检测重金属元素的方法有很多，包括中有比色法和试纸法、酶联免疫吸附等技术[7]、电感耦合等离子体质谱法[8]、原子荧光法[9]等。其中原子荧光方法由于检测灵敏度高，检出限较低，标准曲线相关系数符合要求[10]，样品前处理相对简单等优点被广泛应用到多种样品的检测中[11]。目前原子荧光法样品前处理主要有沸水浴法和微波消解法，沸水浴消解法由于加热时间长，整个加热过程不封闭，可能降低检测准确性，对人体健康有一定危害[12]。微波消解法以微波作为热源将样品加热到200 ℃以上，使用更少量的硝酸将样品消解的更加充分[13]。同时减少了样品中挥发性元素的损失，多数微波消解仪可同时消解大约40 个样品，时间大概是50 min左右，消解的质量和效率满足大批量检测的要求[14]。所以目前微波消解-原子荧光法检测重金属元素被广泛应用在食品检测领域[15]。

本文以质控样检测结果和加标回收率为评价指标，优化前处理和检测过程中还原剂硫脲添加量、硼氢化钾-氢氧化钾的浓度、氨基磺酸和硝酸的添加量和微波消解温度等实验条件，建立适合大批量检测牛奶中重金属元素总砷、总汞的方法，并对方法进行验证和应用，为保障食用无污染的、健康的牛奶提供强有力的保障。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛奶（产自内蒙古呼和浩特）；硝酸、过氧化氢、氨基磺酸、盐酸、硫脲、氢氧化钠、硼氢化钠均为分析纯 上海麦克林生化科技股份有限公司；砷汞标准液 国家标准物质中心。

AFS-933原子荧光北京吉天仪器有限公司；TOPEX+全能型微波化学工作平台；移液器赛默飞世尔科技（中国）有限公司； ME204E电子分析天平，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；实验用水按照GB/T6682规定的一级实验用水。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

参考王晓兰[16]的操作方法并进行优化，称取0.8 g液态牛奶试样于消解管中，加入一定体积的硝酸，2 mL过氧化氢，震荡混合均匀，放置于微波消解仪中消解，消解完毕后冷却至室温，消解管中缓慢加入一定量的氨基磺酸溶液中和硝酸，冷却至室温后用5%的盐酸溶液转移至25 mL的容量瓶中，加入2.5 mL硫脲溶液用5%的盐酸定容，混匀，至少放置30 min后，再上机进行检测。

1.2.2 试剂的配制

（1）混合标准系列溶液的配制

将100 0 μg/mL的砷和汞标准储备液分别稀释到10 μg/mL和1 μg/mL，分别吸取0.25 mL定容于25 mL容量瓶中作为标准中间液；分别吸取0.0 mL 、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL标准中间液于6 个容量瓶中，加一定体积的还原剂硫脲溶液，用5%的盐酸定容至25 mL，混匀后静置反应30 min后上机测定。

（2）试剂及仪器载流液的配制

氨基磺酸（100 g/L）：精确称取10.0 g氨基磺酸，用一级水溶解并定容至100 mL。

硫脲溶液（50 g/L）：精确称取5g硫脲用一级水溶解并定容至100 mL。

盐酸（5%）：量取50 mL盐酸用一级水定容至100 0 mL。

氢氧化钠溶液（3 g/L）：精确称取3.0 g氢氧化钠，用一级水溶解并定容至100 0 mL。

硼氢化钠溶液（10～20 g/L）：称取10～20 g硼氢化钠，用3 g/L的氢氧化钠溶液定容至1 000 mL。

重铬酸钾的硝酸溶液（0.5 g/L）：称取0.5 g重铬酸钾，用硝酸溶液（5+95）溶解并定容至1 000 mL，混匀备用。

（3） 测定仪器条件

砷光电倍增管负高压240 V，砷灯电流60 mA；汞光电倍增管负高压240 V，汞灯电流30 mA；原子化器高度：10 mm，氩气流速：载气300 mL/min，屏蔽气：800 mL/min，采用标准曲线法的测量方式。

1.2.3 结果计算

试样检测后，总砷和总汞含量按照以下公式计算：

式中：

X：总砷或总汞含量（mg/kg）；

C1：待测溶液浓度（ng/mL）；

C0：空白溶液浓度（ng/mL）；

m：样品质量（g）；

V：试样消化液体积（mL）；

1.2.4 单因素与正交实验设计

（1）单因素实验设计设置固定的反应条件。硫脲的添加量为2.5 mL，氢氧化钠浓度为3 g/L，硫脲的添加量为2.5 mL，硼氢化钾-氢氧化钾的浓度为15 g/mL，氨基磺酸的添加量为2.5 mL，硝酸的添加量为5 mL，微波消解最高温度保持时间为20 min。以质控样检测结果和加标回收率为评价指标，分别以还原剂硫脲添加量（40、50、60、70、80 g/L），硼氢化钾-氢氧化钾的浓度（10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 g/L），氨基磺酸添加量（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL）,硝酸添加量(3、4、5、6、7 mL)，微波消解温度（180、185、190、195、200℃）等五个因素进行单因素实验。

（2）正交实验设计

根据单因素实验结果，选取硫脲的浓度（A）、硼氢化钾-氢氧化钾的浓度（B）、硝酸添加量（C）、微波消解温度（D），进行四因素三水平正交实验，优化微波消解-原子荧光法测定牛奶中重金属元素砷和汞的最佳条件，正交因素水平表见表1。

表1 正交因素水平表

1.2.5 方法验证

采用绘制标准曲线方程计算相关系数是否符合要求；通过重现性实验，将同一样本平行进样6 次，计算检测数据的标准偏差；通过精密度实验，将6 个样本处于同一实验条件进样6 次，计算数据的相对标准偏差。

对按照该实验条件检测的质控样本和加标回收率过去一个季度的数据进行分析，在偏差允许的情况下，通过计算加标回收率和质控样本的检测数据验证检测方法的准确性。

1.2.6 牛奶样本检测

按照该方法分析过去半年检测的牛奶样本，对整体数据进行分析，评价检测方法的快捷性、简便性和准确性。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 硫脲的浓度结果分析

硫脲是具有强还原作用的还原剂，可以将消解后样品中的五价砷还原为三价砷[17]。由图1可知，硫脲在40～70 g/L浓度下，采用微波消解-原子荧光法检测重金属元素，总汞的加标回收率变化不显著（P＞0.05），总汞回收率为93.4%～97.1%，硫脲对汞的加标回收率几乎没影响。在牛奶样品中总砷加标回收率显著升高（P＜0.05），砷回收率从76.1%升高到109.3%，当硫脲浓度较低时不能全部还原五价砷；浓度升高时，砷被还原的更多，加标回收率显著升高（P＜0.05），在50 g/L时砷的加标回收率升高到97.2%；当浓度继续增加时，砷的回收率超过100%，表明硫脲的浓度对砷加标回收率影响较大；综合考虑节约试剂和实验效果，回收率接近100%，选择硫脲浓度为50 g/L进行实验。

图1 硫脲浓度对砷和汞加标回收率的影响

2.1.2 硼氢化钾-氢氧化钾的浓度结果分析

硼氢化钾-氢氧化钾是强还原剂，使三价砷和汞还原生成砷化氢和原子态汞，由氩气运载到石英原子化器中，通过特质的砷和汞空心阴极灯的发射光激发下产生原子荧光，与标准系列比较计算[18]。由图2可知，硼氢化钾-氢氧化钾的浓度在10～20 g/L的条件下，砷和汞的加标回收率呈先上升再下降的趋势，当浓度较低时，三价砷和汞未能全部转化为砷化氢和原子态汞，导致检测值较低，当还原剂浓度继续升高时，砷和汞的加标回收率显著升高（P＜0.05）；浓度为15.0 g/L时，砷的回收率为96.1%，汞的回收率为99.6%，当还原剂的浓度继续升高时，砷和汞的加标回收率呈现下降趋势，可能是还原剂浓度较高，在上机器检测时反应特别剧烈，使反应后的溶液有少部分喷出，进而使三价砷和原子态汞产生的原子荧光较低，导致回收率降低[19]。表明硼氢化钾-氢氧化钾的浓度对砷和汞的加标回收率影响较大，综合分析检测时反应的剧烈程度和回收率的大小，反应剧烈容易造成机器堵塞，增加设备维护成本，选择硼氢化钾-氢氧化钾浓度为15.0 g/L进行实验。

图2 硼氢化钾-氢氧化钾浓度对砷和汞加标回收率的影响

2.1.3 氨基磺酸添加量结果分析

氨基磺酸主要中和前期加入的硝酸溶液，去除硝酸根离子、亚硝酸根离子和挥发性氮氧化物产生二氧化氮和氮气，防止硝酸与硫脲反应生成氢气，进而消耗原子态汞生成汞化氢，同时避免五价砷不能充分被还原为三价砷[20]。由图3可知，在氨基磺酸添加量在1.5～3.5 mL时，总砷和总汞的加标回收率先显著上升（P＜0.05），在氨基磺酸添加量在2.5 mL时，总砷的加标回收率达到95.6%，总汞的加标回收达到99.4%，氨基磺酸添加量继续增大，总砷和总汞的加标回收率变化不显著（P＞0.05），可能是因为氨基磺酸添加量为2.5 mL时正好中和硝酸，避免了硝酸与硫脲反应，对砷和汞的加标回收率产生影响[21]。表明氨基磺酸添加量为2.5 mL时中和硝酸效果较好，继续增大添加量对回收率影响不显著（P＞0.05），所以在后续正交实验对该因素不再进行深入研究，选择氨基磺酸添加量为2.5 mL进行后续实验。

图3 氨基磺酸添加量对砷和汞加标回收率的影响

2.1.4 硝酸添加量结果分析

硝酸是强氧化剂可以消解大多数无机样品和容易消解的有机样品，是最常用的消解试剂[22]，通常与双氧水配合使用，提高消解效率。由图4可知，当硝酸的添加量在3～5 mL范围时，随着硝酸添加量不断增加，样品消解越充分，砷和汞的加标回收率显著升高（P＜0.05）。当硝酸添加量为5 mL时，砷的加标回收率为97.6%，汞的加标回收率为99.8%，回收率接近100%，表明样品消解的充分。当硝酸的添加量继续增大时，砷和汞的加标回收率变化不显著（P＞0.05）。综合考虑到消解效果和过量硝酸对实验的影响，选择硝酸添加量为5 mL。

图4 硝酸添加量对砷和汞加标回收率的影响

2.1.5 微波消解温度结果分析

微波消解是应用比较广泛的一种消解方式，消解温度可达200 ℃，消解效率比较高。由图5所示，微波消解温度在180～195 ℃范围内，随着消解温度的不断升高，样品消解更加充分，汞的加标回收率显著升高（P＜0.05），在消解温度为195 ℃时，砷的加标回收率为99.1 %，汞的加标回收率为99.8 %。随着消解温度继续增加，砷和汞的加标回收率变化不显著（P＞0.05），表明微波消解温度在195 ℃时样品消解充分，不用再提高消解温度。综合考虑消解温度提高后，消解管的压力增加较大，耗能增加[23]，所以选择消解温度为195 ℃继续实验。

图5 微波消解温度对砷和汞加标回收率的影响

2.2 正交实验结果分析

2.2.1 正交实验设计与结果分析

正交实验设计与结果如表2所示，影响总砷加标回收率因素主次顺序为：C、A、B、D，实验组A1B2C2D2的回收率最高为99.3%，理论最优组合是A2B2C2D2。影响总汞加标回收率因素主次顺序为B、C、A、D，实验组A2B2C3D1的回收率最高为98.7%，理论最优组合为A2B2C2D2。总砷和总汞加标回收率实验组最优组和理论最优组回收率不同，需要进行验证性实验。

表2 正交实验设计与结果

表3 标准曲线方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限的实验结果

2.2.2 验证性实验结果分析

通过正交实验结果分析，对A2B2C2D2进行验证性实验，重复三次。总砷加标回收率为99.8%±0.8%，比实验组A1B2C2D2的回收率更加接近100%，以A2B2C2D2为最佳实验条件。总汞加标回收率为99.6%±1.1%，回收率比实验组A2B2C3D1更加接近100%，以A2B2C2D2为最佳实验条件。所以检测砷和汞加标回收率的最佳实验条件为：硫脲的浓度为50 g/L、硼氢化钾-氢氧化钾的浓度为15 g/L、硝酸添加量为5 mL、微波消解温度为195 ℃。

2.3 方法验证实验结果分析

2.3.1 标准曲线方程结果分析

采用标准曲线的方法进行方法验证，砷和汞的标准曲线为分别配置浓度为0、2、4、6、8、10 ng/mL的砷标准梯度溶液和浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ng/mL的汞标准梯度溶液，按照最优实验条件进行检测。砷的标准曲线方程为Y=80.71X-9.43，相关系数为0.999 7，线性范围是0～10 ng/mL，检出限和定量限分别为0.01 mg/kg、0.04 mg/kg。汞的标准曲线方程为Y=929.74X-7.55，相关系数为0.999 2，线性范围是0～1 ng/mL，检出限和定量限分别为0.003 mg/kg、0.01 mg/kg。经分析砷和汞的标注曲线方程满足后续实验相关要求。

2.3.2 重现性实验结果分析

取牛奶样品分别经前处理后进行检测。样品中砷和汞的含量并计算相对应的平均值和RSD。结果如表4所示，样品中砷和汞的加标回收率平均值和RSD值分别为99.39%、0.11%，98.81%、0.18%。砷质控样本浓度为0.145 mg/kg，检测结果平均值为0.147 mg/kg，RSD为3.8，表明采用该方法检测砷质控样数据符合要求；汞质控样本浓度为0.044 6 mg/kg，检测结果平均值为0.043 8 mg/kg，RSD为4.29，表明采用该方法检测汞质控样数据符合要求。通过检测加标回收和质控样本数据均符合要求，表明该方法可以用于检测牛奶中砷和汞。

表4 重金属元素质控和加标回收率样本的重现性实验结果

2.3.3 精密度实验结果分析

采用同样的方法分别进行6次实验，计算数据的平均值和RSD。结果如表5所示，样品中砷的加标回收率、质控检测平均值和RSD值分别为99.35%、0.59，0.205 mg/kg、3.28。砷采用的质控样本浓度为0.197 mg/kg，质控样检测值符合准确性要求，表明可以使用该方法检测牛奶中重金属砷。汞采用的质控样本浓度为0.057 3 mg/kg，采用此方法质控样检测值为0.056 8 mg/kg，标注偏差符合实验要求，表明可以采用此方法同时检测牛奶中重金属元素砷和汞。

表5 重金属元素质控和加标回收率样本精密度的实验结果

2.3.4 加标回收率和质控样本实验结果分析

采用此方法对样品检测过程中，每周做一次加标回收率和质控样本检测判断该方法的准确性，对最近一个季度的数据进行分析。如表6所示，砷和汞分别做了12次加标回收率检测，平均值分别为98.84%、99.23%，RSD分别为1.91、1.01，回收率和RSD均符合数据分析要求。砷和汞进行了两个浓度的质控样本检测各12次，砷的质控样本浓度分别为0.145 mg/kg、0.197 mg/kg，采用此方法的检测平均值分别为0.146 mg/kg、0.204 mg/kg，RSD分别为3.80、3.71，经过检测质控样本说明此方法检测结果准确可靠。汞的质控样本浓度分别为0.044 6 mg/kg、0.057 3 mg/kg，检测值为0.044 5 mg/kg、0.056 5 mg/kg，RSD分别为2.79、3.05，砷检测值偏差符合质控要求，表明可以应用此方法检测牛奶样本中的重金属元素砷和汞。

表7 牛奶砷汞检测结果

2.4 牛奶样本检测结果分析

采用此方法检测牛奶中重金属元素砷和汞，对过去6个月的检测数据进行分析。如图6所示，6个月共检测样品5 098个，砷检测值超过检出限的有34个，第四个月份时检出最多为9 个，检出率为1.07%，最低的为3月检出2 个，检出率为0.23%。汞共检出26个，3月的检出率最高为1.04%，4月的检出率最低为0.12%。通过本实验采用的6个月份实验数据进行分析，表明这些批次牛奶重金属元素砷和汞检出率较低，奶源受污染的概率较低。此检测方法的优化为严格控制市场奶源重金属污染贡献力量。

图6 砷和汞标准曲线方程拟合结果（A）砷、（B）汞

3 结论

通过对原剂硫脲的浓度、硼氢化钾-氢氧化钾的浓度，氨基磺酸的添加量,硝酸的添加量、微波消解温度等前处理和上机条件做单因素和正交实验优化，成功建立了同时快速准确检测牛奶中重金属元素砷和汞的检测方法。在一定的质量浓度范围内，标准曲线方程相关系数大于0.999，质控和回收率检测结果精密度、准确度符合要求，方法检出限和定量想满足日常检测要求。为加大牛奶中重金属元素砷和汞的监管奠定基础，为一线重金属相关检验人员提供方法参考。