不同检测方法对奶牛嗜血支原体病流行病学的调查

2023-12-24刘志彬

中国乳业 2023年11期

刘志彬

香河县农业农村局，河北廊坊 065400

0 引言

嗜血支原体（Mycoplasma wenyonii）是一种无细胞核、细胞壁和细胞器的原核生物，活动能力较强，形态多样，大多寄生于红细胞表面、血浆和骨髓中。嗜血支原体自1928年首次在切除脾的鼠体中发现以来，已在牛、猪、犬、兔、羊、鸡等多种动物和人体内发现[1]。该病原体早期称附红细胞体，归为立克次氏体目，但根据电镜观察及16S rRNA基因序列分析结果，因与肺炎支原体密切相关，被划为支原体属[2，3]。奶牛嗜血支原体病是由牛嗜血支原体引起的以发热、黄疸、贫血为主要症状的人兽共患病，可经血液、消化道、虫媒介等多种途径传播，四季流行，夏季多发。各年龄阶段奶牛均可感染发病，出现体重下降，生长阻滞，怀孕奶牛流产或胎衣不下，泌乳牛产奶量明显减少的多样化临床症状。感染奶牛通常发病较慢，呈隐性感染，是潜在病原体的携带者和重要传染源，往往被养殖者忽视。同时，由于长期携带病原体，导致感染奶牛机体免疫力降低，容易造成其他病原微生物侵入而继发或混合感染疾病。该病在奶牛养殖场流行较广，感染率可达86.2%[4]，严重影响奶牛养殖经济效益和健康发展。

准确鉴定病原体对及时预防和治疗该病具有重要作用。目前，实验室诊断该病方法较多，如镜检方法（包括直接血液涂片法、悬滴压片法、姬姆萨染色法、瑞氏染色法）、血清学检测方法、聚合酶链反应（PCR）法等。基层兽医临床多采用镜检方法作为常规检测手段，但容易出现误诊，准确度不如PCR等分子生物技术高，要准确检测病原体需进一步借助分子生物技术。因此，需寻求更接近PCR技术的常规检测方法应用于临床诊断，必要时进一步采用PCR确诊。河北省香河县奶牛养殖有一定规模，但针对该病的流行情况缺乏系统、全面调查。为了解该病在本地区的感染态势，本研究于2021年3月—2022年7月在香河县采集9 家奶牛养殖场2 562头奶牛血样，采用镜检和PCR结合方法进行嗜血支原体病原学检测，分析感染情况，为防治奶牛嗜血支原体病提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验设计

2021年3—4月在香河县8 家奶牛养殖场选取泌乳牛781 头，每头牛颈静脉部位采集全血10 mL，装入含3.8%柠檬酸钠的离心管，-20 ℃保存备用。采用直接涂片法、血液悬滴压片法、姬姆萨染色法、瑞氏染色法和PCR方法分别对781 份血样检测嗜血支原体，通过比对阳性率，选择与PCR方法阳性率接近的镜检方法，同时对奶牛不同年龄阶段、不同季节和垂直传播的感染情况进行调查。2021年5月，在6 家奶牛养殖场根据不同年龄阶段（犊牛、青年牛、泌乳牛）选取810 头奶牛检测嗜血支原体。2021年6月—2022年7月，在9 家奶牛养殖场选取971 头奶牛根据不同季节分类检测嗜血支原体。同时，另选取30 头病原体阳性的妊娠奶牛，分别于产前7 d尾静脉采血、产后新生犊牛脐静脉采血，检测垂直传播的感染情况。

1.2 主要试剂

全血基因组DNA提取试剂盒购自Promega公司；r Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、d NTP等PCR相关试剂购自TaKaRa公司；瑞氏染色液、姬姆萨染色液等试剂购自南昌雨露实验器材有限公司。

1.3 引物

根据GenBank数据库收录的嗜血支原体 16S rRNA基因序列（登录号：AY946266），利用Primer5.0软件设计一对种特异性引物。上游引物F：5'-CGAACGAGTGGAACTTGTTCTGC-3'，下游引物R：5'-TAGTACCATCAAGGCGTGCTC-3'，由上海英骏生物技术有限公司合成。预计扩增片段大小为415 bp。

1.4 镜检方法

参考杨红英[4]等报道的方法对血液样本分别采用血液悬滴压片法、直接涂片法、姬姆萨染色法、瑞氏染色法进行嗜血支原体镜检，并观察结果。阴阳性结果判断标准：每份血液样本在4×100 倍光镜下观察20 个视野，红细胞中可见1 个嗜血支原体者，判为阳性，未观察到嗜血支原体者，判为阴性。

感染强度判定标准：每份血样记数100 个红细胞，红细胞感染率≤25%者为“＋”；25%＜红细胞感染率≤50%者为“＋＋”；50%＜红细胞感染率≤75%者为“＋＋＋”；75%＜红细胞感染率≤100%者为“＋＋＋＋”[5]。

1.5 PCR 检测

取血液样本以3 500 r/min离心5 min，收集上清液，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，以DNA为模板，利用P1/P2引物进行PCR扩增检测。50 μL扩增体系25 μL：d NTP 5 μL，MgCL2 3 μL，r Taq DNA聚合酶1.25 μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，加无菌水至25 μL。反应条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，运行共32 个循环，最后，72 ℃终延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察目的片段。

1.6 统计分析

采用SPSS 20.0软件对不同检测方法结果进行方差检验，P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 不同方法检测奶牛嗜血支原体阳性率的结果比较

采用4 种不同方法对7 8 1 头奶牛血样进行嗜血支原体检测，结果发现（表1），悬滴压片法、姬姆萨染色法、瑞氏染色法获得血样阳性率均高于PCR法，但各组之间差异不显著（P＞0.05）。直接涂片法显著高于其他检测方法（P＜0.05）。

表1 不同方法检测奶牛嗜血支原体阳性率的结果比较

2.2 不同年龄阶段的奶牛嗜血支原体阳性率和发病率比较

悬滴压片法和PCR法检测泌乳牛感染的阳性率和发病率均显著高于犊牛和青年牛（P＜0.05）。不同年龄阶段的PCR感染阳性率和发病率依次为：泌乳牛＞犊牛＞青年牛（表2）。

表2 不同年龄阶段的奶牛嗜血支原体阳性率和发病率比较

2.3 不同季节的奶牛嗜血支原体阳性率和发病率比较

夏季奶牛嗜血支原体阳性率最高（表3），P C R 检测阳性率6 0.8 5%，与其他季节差异显著（P＜0.05）；秋季显著高于春季和冬季（P＜0.05）。

表3 不同季节的奶牛嗜血支原体阳性率和发病率比较

2.4 奶牛嗜血支原体的垂直传播情况

选择无任何临床症状的阳性妊娠奶牛所产的30 头新生犊牛，采用血液悬滴压片法检测嗜血支原体阳性率为83.33%，PCR法阳性率73.33%，妊娠奶牛、新生犊牛发病率分别13.33%、10.00%（表4），两者无显著性差异（P＞0.05），结果表明嗜血支原体可由妊娠奶牛垂直传播给犊牛。

表4 奶牛嗜血支原体的垂直传播情况

3 讨论

近年来，我国奶牛养殖规模化程度逐步提高，饲养管理走向精细化，但一些奶牛养殖场的饲养管理技术和疫病防治手段还无法彻底遏制嗜血支原体病的传染，尤其是大量散养模式生产进一步增加了防控难度。此外，从该病流行特点看，感染奶牛多无临床表现，发病率不高，而嗜血支原体阳性率仍较高，流行广泛，且病原体可经母体垂直传播，这给该病净化防控带来很大困难。因此，在嗜血支原体感染奶牛早期，采取科学有效的诊断方法发现并及时确诊，对了解奶牛感染水平和实施疫病净化措施尤为重要。

目前，常规的奶牛嗜血支原体病原学诊断方法主要为血液镜检方法和PCR法[6]。血液镜检方法是诊断附红细胞体病常用方法之一，但存在许多不足，容易造成误诊[7]。本研究采用4 种不同检测方法对781 头奶牛血样进嗜血支原体检测，发现直接涂片法、血液悬滴压片法、姬姆萨染色法、瑞氏染色法获得血样阳性率均高于PCR法，这与周作勇等[8]报道一致。分析原因主要有：一是直接涂片法和血液悬滴压片法都容易导致红细胞变形而被误判为阳性血样，出现假阳性样本，造成感染率高于实际数量。瑞氏染色法和姬姆萨染色法也都可能存在染色液颗粒沉着于红细胞表面而被误判为嗜血支原体。二是奶牛可能同时感染嗜血支原体和其他形态相似于嗜血支原体的血液寄生虫（如无形体），镜检时很难区别[8]。作为现代分子生物技术的PCR法具有灵敏性高、特异性、准确性可靠的特点[9]，适合群体性检测，可作为实验室确诊手段之一。本研究结果显示，血液悬滴压片法最接近PCR法的检测结果，临床上可采用该法作为早期诊断，必要时结合PCR法确诊，有助于提高感染率准确性。

奶牛感染嗜血支原体不分年龄阶段，但年龄差异影响阳性率高低。黄占欣等[5]报道，邯郸地区奶牛附红细胞体感染率和发病率中，犊牛感染率最高为62.3%、发病率为9.2%，其次是泌乳牛感染率为52.6%、发病率为1.9%，而青年牛感染率和发病率相对较低，分别为48.2%和0.0%。本研究结果显示，不同年龄阶段PCR感染阳性率和发病率依次为：泌乳牛＞犊牛＞青年牛，其中泌乳牛与犊牛、青年牛具有显著差异。上述研究结果可能与自然饲养环境、奶牛感染强度、检测方法等因素有关。

季节性也是影响奶牛感染嗜血支原体的重要因素，虽然该病发生无明显季节性，但吸血节肢动物（螨、蜱、虱、蚊、蚤、螫蝇、蠓等）是动物嗜血支原体传播扩散的主要媒介，若在夏秋季节，即吸血节肢动物的孳生时期，在应激因素影响下可能引起地方性流行[10]。本研究结果显示，夏季是该病感染的高发期，显著高于其他季节（P＜0.05），其次为秋季。虽然夏季发病率最高，但与其他季节无差异显著性（P＞0.05）。夏季气温高，多雨潮湿，圈舍环境易滋生蜱、螨等吸血节肢动物，奶牛感染嗜血支原体与体外寄生虫密切相关。因此，建议在每年夏季来临前、夏季感染高峰期间和初秋3 个时间节点集中进行药物防治和卫生消毒。本研究发现感染嗜血支原体的奶牛阳性率高，而发病率相对偏低，表明嗜血支原体致病力较弱，这与彭海生等[11]研究一致。

垂直传播是奶牛嗜血支原体感染途径之一。本研究中30 头妊娠母牛均感染嗜血支原体，发病率13.33%，经过分娩，30 头新生犊牛血液悬滴压片法的检测阳性率为83.33%、PCR法的阳性率为73.33%，表明无论发病或隐性感染，妊娠奶牛都可通过垂直传播感染新生犊牛。这与李玉文等[12]、李子平等[13]和闫振贵等[14]报道一致。