健脾消渴方干预2 型糖尿病大鼠的生物学基础研究

邓龙飞，王 骏，高 柳，顾晶晶，潘菊香，黄珍祯，姚静雯*

（1.上海市浦东新区中医医院 药剂科，上海 200120；2.上海中医药大学 科技实验中心，上海 200120）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一种全球普遍性的代谢性疾病，主要临床指征为胰岛素分泌的绝对或相对不足，最终导致糖脂代谢功能的紊乱，呈现高血糖状态[1]。T2DM 后期伴随众多慢性严重性并发症，已成为危害人类健康的世界性问题[2]。中药方剂在治疗糖尿病上有着自身独特的中医理论基础和较好的临床疗效，因此开展中药防治T2DM 研究，既促进中药机制探索，同时契合临床研究实际需求。

糖尿病在传统中医理论上归于“消渴”范畴。健脾消渴方源于古方消渴方，出于《丹溪心法》，书中无固定剂量，由全国名老中医程益春教授“健脾降糖饮”加减化裁而成[3]。该方组成基本固定，由生黄芪、生天花粉、黄连、生地黄、川牛膝和佩兰组成[4]。目前，健脾消渴方被运用于临床治疗T2DM 效果较为显著，且安全性较高。有临床研究表明，健脾消渴方治疗T2DM 有效率高，且未有明显的不良反应[5]；另一项中国临床研究针对健脾消渴方治疗T2DM 的临床特点及规律，结果表明健脾消渴方在治疗T2DM 病程较长且年纪较长者表现更好，证实了健脾消渴方的临床疗效[6]。

本研究采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱（UPLC-Triple-TOF-MS）分析系统，对健脾消渴方干预T2DM 大鼠的尿液非靶向代谢组学研究，筛选潜在的生物标志物和高信号强度的信号通路，为健脾消渴方临床合理应用奠定理论基础，也为安全用药提供依据。

1 材料

1.1 试剂与溶剂

链脲佐菌素Streptozotocin (S0130，Sigma 公司)；盐酸二甲双胍［ACF0491，默克制药（江苏）有限公司］；Zoletil®50（8PEJA，Virbac 公 司）； LC/MS 级甲 醇（A456-4）、LC/MS 级 乙 腈（A955-4）、LC/MS级甲酸（A117-50）、HPLC 级异丙醇（A451-4）、超纯水（W6-4），均购自美国Fisher Chemical 公司。

1.2 主要仪器

Vanquish Horizon 型UHPLC 液 相 色 谱 系 统、Q-Exactive system 型质谱仪（美国Thermo Scientific公司）；Wonbio-96c 型高通量组织破碎仪（上海万柏生物科技有限公司）；Centrifuge 5430R 型冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）。

1.3 动物及试药

动物：40 只SD 大鼠，体质量为（180±20）g，雄性，SPF 级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于上海中医药大学动物实验中心。

健脾消渴方：中药饮片购于上海养和堂中药饮片有限公司，经上海浦东新区中医医院药剂科潘菊香教授鉴定为正品。该方组成如下：生黄芪30 g（批 号：2022071608），天 花 粉15 g（批 号：20220614）， 生 地15 g（ 批 号：2022070408）， 黄连9 g（批号：2022072308），川牛膝15 g（批号：20220328），佩兰12 g （批号：20220419），加8 倍量水，浸泡30 min，煎煮2 次，每次40 min，合并2次提取液，浓缩至2 g/mL。

2 方法

2.1 分组、造模及给药

造模：以高膳食+STZ（链脲佐菌素）诱导Ⅱ型糖尿病大鼠为模型。SD 大鼠适应性喂养1 周后，随机分组，除正常组外，其余大鼠均给予高膳食饲料进行喂养，持续4 周。高膳食饲料配方组成：蛋黄粉5%、蔗糖20%、猪油15%，普通饲料60%，由动物实验中心委托上海帆泊生物技术有限公司定制。喂养4 周后，对SD 大鼠禁食不禁水12 h，以2%STZ 溶液进行左下腹腔注射，剂量为35 mg/kg。造模3 d 后，检测造模大鼠，以随机血糖≥16.7 mmol/L 提示造模成功[7]。不达标者，可通过腹腔注射STZ 10 ～ 20 mg/kg进行二次造模，随机血糖≥16.7mmol/L 并稳定1 周，可视为造模成功。

分组及给药：共分为4 组，正常对照（NC）组、模型对照（Model）组、健脾消渴方（JPXK）组、盐酸二甲双胍（Met）组。JPXK 组给药（中药提取浓缩液）剂量为20 g/kg，Met 组为200 mg/kg，其余各组灌胃等剂量蒸馏水。持续4 周给药后，腹腔注射Zoletil®50（舒泰50）进行麻醉取材，大鼠麻醉剂量为40 mg/kg，该实验检测所用样本为尿液。

2.2 样本处理

样本处理：精确移取200 μL尿液样本于EP管中，向EP 管中加 800 μL 提取液(甲醇:乙腈=1 : 1)于样品中，涡旋（30 s）混匀后，低温超声萃取30 min（5℃，40 kHz），将样品静置于-20 ℃，30 min 后，13 000 r/min，4 ℃，离心15 min，离心取全部上清液，抽干，加100 μL 复溶液(乙腈:水=1 : 1)进行复溶，低温超声萃取5 min（5℃，40 kHz）；5 min 后，13 000 r/min，4℃，离心15 min。离心取上清液，转移至LC-MS 进样小瓶上机分析。

QC 样本：即质控样本，由等体积的所有样本代谢物混合组成，在该次的仪器分析过程中，与原样本设定10 : 1 比例插入混检，目的考察整个实验分析中的重复性。

2.3 LC-MS 检测

色谱条件：取10 μL 样本，由BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）分离后进入质谱开始检测。流动相A：水（含0.1%甲酸），流动相B：乙腈/异丙醇（1/1）（含0.1%甲酸）。分离梯度：0 ～ 3 min，5%→20%B； 3 ～ 9 min，20%→95%B；9 ～ 13 min，95%B；13.0 ～ 13.1 min，95% →5%B；13.1 ～ 16 min，5%B。流 速：0.40 mL/min；柱 温：40℃。

质谱条件：采用正负离子扫描模式进行该次实验样品质谱信号采集，质量扫描范围（m/z）：50 ～1 000。离子喷雾电压，正离子电压为5 000 V，负离子电压为4 000 V，去簇电压为80 V，喷雾气为50 psi，辅助加热气为50 psi，气帘气为30 psi，离子源加热温度为500 ℃，20 ～ 60 V 循环碰撞能。

2.4 数据分析

将获得的LC-MS 原始数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI 进行处理，包括基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐，获得最终数据矩阵（包含保留时间、质荷比和峰强度等信息），数据矩阵用80%去除缺失值， 即保留至少一组样品中非零值 80%以上的变量，再进行填补空缺值（原始矩阵中最小值填补空缺值）。用总和归一化法对获得样本的质谱峰的响应强度进行归一化处理，目的在于减小样品制备及仪器不稳定等因素产生的误差，获得处理过后的数据矩阵。同时保留QC样本相对标准偏差（RSD）＜30%的变量，并进行保留数据的log10 对数化处理，获取最终用于后续分析的数据矩阵。将MS 和MSMS 质谱信息与相关代谢数据库进行注释匹配，主要数据库为HMDB 等公共数据库、Majorbio 数据库及Metlin 数据库等。

3 结果

3.1 UPLC-Triple-TOF-MS 分析尿液样本

对健脾消渴方干预T2DM 各组大鼠的尿液样本进行数据分析，精密度和稳定性考察结果符合要求。所获得的分析数据表明，各组大鼠尿液中代谢物分离度较好，满足了非靶向代谢组学对于代谢物的全面性、整体性的标准。与NC 组相比，Model 组代谢物的TIC 图出现了明显差异，表明Model 组造模成功；在健脾消渴方及阳性药干预治疗后，TIC 图中分离度、峰数目等相对于Model 发生变化，并趋向于NC 组靠拢，提示药物具有较好的治疗效果，见图1。

图1 各组大鼠尿液样本负离子模式下的TIC 图Fig.1 TIC diagram of urine samples of rats in each group in negative ion mode

3.2 总代谢物注释信息

对各组大鼠尿液样本进行非靶向代谢组学实验分析，获取的总代谢物进行注释到相应数据库获得对应信息。注释到HMDB 数据库结果表明总代谢物分类情况，主要以有机酸及其衍生物22.27%、脂质和类脂质分子19.33%、有机杂环化合物18.81%为主（图2A）；通过注释到KEGG 化合物数据库结果表明，KEGG 化合的第一分级上，总代谢物主要以脂质、肽、有机酸、碳水化合物为主，包括了羧酸、氨基酸、单糖、磷脂等（图2B）；注释到KEGG 信号通路数据库展示了其涉及的核心通路为代谢、人类疾病等领域，包括了氨基酸代谢、其他次级代谢物的生物合成、脂质代谢等（图2C）。

图2 总代谢物注释信息：HMDB 数据库结果（A）、KEGG 化合物数据库结果（B）和KEGG pathway 数据库结果（C）Fig.2 Total metabolite annotation information: HMDB database results (A), KEGG compound database results (B) and KEGG pathway database results (C)

3.3 样本比较分析

进一步对获得的差异代谢物进行深度挖掘信息，并进行样本间的比较分析。Heatmap 图（阳离子检测模式）展示了NC 组与其余三组代谢产物表达差异程度较大，具有显著性意义，提示造模成功；JPXK 组与NC 组聚类层级接近，提示其样本具有相关性；Model 组与NC 组相距最远，提示了Model 组大鼠内在代谢出现紊乱，见图3A。

图3 样本比较分析热图（A）及PCA 分析结果（B）Fig.3 Sample comparative analysis heatmap (A) and PCA analysis results (B)

PCA 分析表明，在正离子模式下，NC 组与其余三组代谢产物分离度较高，代谢产物表达轮廓区分明显；JPXK 组与Model 组相比，分离度相对较高，有重合区域也有各自独有区域，提示了在健脾消渴方干预T2DM 大鼠后，对尿液代谢差异代谢物产生改变；随后将采用有监督的多维统计分析方法PLS-DA 分析对两组样本之间的差异进行模型分析，见图3B、表1。

表1 PCA 分析Scores 图的模型参数表Tab.1 Model parameter table of PCA analysis scores plot

采用PLS-DA 分析针对性比较两组间差异性。由图4（A1、B1）可知，各两组间的分离度较好，造模后，Model 组代谢产物数据已开始偏离NC 组，对Model组给予JPXK 治疗后代谢产物差异性明显。同时，对上述2 个PLS-DA 分析进行模型验证，通过200 次置换检验对PLS-DA 模型进行验证，确保未发生过拟合，置换检验评价的标准为Q2回归线与Y轴的截距，截距小于0.05 表明模型稳健可靠，未发生过拟合，见图4（A2、B2）。

图4 PLS-DA 分析针对性比较两组间差异性Fig.4 The PLS-DA analysis compared the differences between the two groups

3.4 组间差异代谢物分析

针对Model 组和JPXK 组的差异性代谢物进行比较分析，在阳+阴离子检测模式下，显著性差异代谢物定义为P_value ＜0.05，VIP_pred_OPLS-DA ＞1，共计589 个差异代谢产物，其中上调差异性代谢物为209 个，下调差异代谢物为380 个（图5A）；对589个差异代谢产物进行KEGG Compound 分类，差异代谢物中，主要集中在Lipids 和Peptides 领域，包括了氨基酸、羧酸、磷脂和脂肪酸（图5B）。

图5 JPXF 组与Model 组的差异代谢物火山图（A）及KEGG Compound 分类（B）Fig.5 Volcano map (A) and KEGG compound classification (B) of differential metabolites between JPXF group and Model group

3.5 差异代谢物识别及分析

3.5.1 构建潜在生物标志物代谢集 基于前期研究中PLS-DA 及OPLS-DA 分析，以设定VIP 参数大于1 为条件，对组间两两比较展开筛选，数据实际处理时发现差异物数量较多，不利于后续分析，故提高参数筛选条件，选择 VIP ＞1.5 的化合物，再结合独立t检验的P＜ 0.01 筛选出符合要求的化合物即为潜在生物标志物。分析所得数据繁杂。将重点关注的方向集中在NC 组与Model 组，发生了显著性变化的差异代谢物（341 个），并且在JPXK 的干预治疗下（329 个），又发生了显著性变化的某些特定代谢产物，共筛选出60 个内源性化合物发生了上述改变，视为潜在的生物标志物，包括辅酶B、二十二碳六烯酸、LysoPC［(20 : 4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0 : 0)］、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、鸟氨酸、水苏糖、棕榈酰肉碱、硫酸去甲肾上腺素、12-epi-LTB4 等。同时创建潜在生物标志物专属代谢集，注释到KEGG 数据库比对。在KEGG 数据库中具有对应信号通路的15 个潜在生物标志物的相关信息，涉及的主要信号通路为碳代谢、甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢、色氨酸代谢、花生四烯酸代谢、半乳糖代谢，详细信息见表2。

表2 生物标志物相关信息表Tab.2 Table of information related to Biomarkers

3.5.2 VIP 值分析 通过聚类热图和变量权重值（VIP）条形图的联合使用，可展示各组中代谢物在各样本中的表达和代谢物在多元统计分析的VIP 和单维统计中的P值，从而直观的看出差异代谢物的重要性和表达量的趋势变化。选取VIP 值前20 统计分析，见图6，Model 组和JPXK 组相比，丰度排名前20 的代谢物丰度差异明显，相比于Model 组，JPXK组包括莽草酸、薯蓣皂苷D、绿花碱、Marmesin rutinoside 及L-丙氨酸等丰度前20 的代谢物含量水平均出现上调。

图6 VIP 值前20 差异代谢物的相对表达及显著性分析Fig.6 Relative expression and significance analysis of the top 20 metabolites of VIP

3.6 差异代谢物的KEGG 信号通路挖掘

考虑中药干预后，可能对T2DM 大鼠干预新的信号通路，产生新的差异代谢物，并不包含于上述挖掘的共同潜在生物标志物范围中，因此，直接将各组间比较得到的差异代谢物利用KEGG 数据库，通过KEGG 通路富集，利用MetaboAnalyst 软件将代谢集中的代谢物按照其参与的pathway通路进行分析（图7），用以完善整体数据挖掘信息。结果表明，健脾消渴方改善T2DM 与色氨酸代谢相关性最强，此外，可能通过苯丙素类的生物合成、类苯丙酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成进行调节。

图7 Model 组与JPXK 组的差异代谢物的KEGG 通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis of differential metabolites between Model and JPXK group

4 讨论

研究结果表明健脾消渴方干预T2DM 大鼠尿液中的潜在生物标志物包括了色氨酸、硫酸去甲肾上腺素、LysoPC(20 : 4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0 : 0)等物质，涉及的主要信号通路为氨基酸代谢、脂肪酸代谢、色氨酸代谢、花生四烯酸代谢等代谢通路。

健脾消渴方干预后，尿液中硫酸去甲肾上腺素、色氨酸等含量上升，表明与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成关系密切[8]。去甲肾上腺素已被证实具有免疫调节及抗炎作用，而系统性炎症是T2DM 重要的表征之一，抗炎有助于改善T2DM[9]，该成分含量上调，揭示了健脾消渴方具有一定抗炎作用。色氨酸是表达5-羟色胺的前体，其生物合成途径异常必然会负反馈5-羟色胺表达，从而导致神经系统出现功能障碍及炎症，这也是糖尿病并发症中多出现周围神经病变的原因[10]。健脾消渴方改善上述成分的表达，提示其可能具有一定的保护神经系统功能性作用，值得进一步深入研究。T2DM 患者普遍存在糖代谢异常，与多个代谢途径（葡萄糖生成、糖酵解/糖异生、三羧酸循环等）紧密相关[11]，健脾消渴方干预多信号通路研究结果夯实了这一结论。

在T2DM 病程中，脂质代谢异常可进一步加重胰岛素抵抗（IR）[12]。健脾消渴方可上调二十二碳六烯酸（多不饱和脂肪酸PUFAs）含量表达，可多途径维持细胞膜的稳定性，减轻炎症损伤，调节细胞功能[13]。溶血磷脂酰胆碱LysoPC(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0)为脂质类成分，可调节机体胰岛素分泌，积极参与脂质代谢和糖尿病的进程[14]，健脾消渴方干预后相对含量上调，总体趋向于正常含量表达，基于lysoPC 和lysoPE 为炎症及体内氧化应激相关代谢的中间产物，推荐作为特征性指标，可协助预测早期糖尿病[15]。

5 结论

本研究利用LC-MS 技术分析了健脾消渴方干预T2DM 代谢相关的物质基础和可能的信号通路，为该中药方剂的临床使用及合理用药提供实验依据。目前单一的非靶向代谢组学的研究仍显得不够完善，后续研究将结合关键性的分子信号通路，多组学多技术联用，探索新的药物作用靶点，进一步挖掘健脾消渴方干预T2DM 的作用机制。