通窍活血汤治疗血管性痴呆大鼠的机制研究

卢美住，卢昌均， 徐 榛，周 芝，顿玲露

（1.广西中医药大学第三附属医院 神经内科，广西 柳州 545001；2.广西中医药大学 研究生院，广西 南宁 530200）

血管性痴呆（VD)是一种常见的痴呆类型，主要继发于缺血性或出血性卒中等脑血管病，是一组获得性的慢性进行性疾病，临床主要表现为学习记忆、认知功能障碍，因而又称为“卒中痴呆”[1]。调查研究显示，随着老龄化增长和危险因素的流行，卒中发病率在逐年上升[2]。VD 常继发于卒中等脑血管病，VD 的发生不仅会对患者神经功能的恢复有严重影响，还会增加致残率和死亡率，目前尚无有效治疗方法[3-5]。神经元凋亡是卒中后神经功能进行性恶化最关键的因素，而脑缺血缺氧、低灌注及再灌注损伤均可加剧神经元自噬与凋亡，从而导致卒中后认知功能障碍，甚至造成VD，故寻找具有抗神经元凋亡的药物对治疗具有重要意义。

通窍活血汤出自《医林改错》，其书中记载该方可“治头面、四肢、周身血管血瘀之证”，说明其有着活血通络、开窍醒神之功，而瘀血阻滞脑络、脑窍失养是临床上引起卒中和VD 最常见的原因，现代医学研究也证明通窍活血汤具有保护血管内皮细胞、降低氧化损伤、减轻脑组织水肿、抑制细胞凋亡、改善脑循环及促进神经元修复的作用[6-8]。本研究通过建立VD 大鼠模型，从神经元保护角度探讨通窍活血汤的作用机制，为临床使用通窍活血汤治疗VD 提供更多的实验依据。

1 材料

1.1 动物

选 用60 只 健 康 雄 性SD 大 鼠， 体 质 量 为（220±20）g（长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK 湘 2019-0013），并在实验室适应性饲养2 周，实验室喂养标准：环境安静，空气通畅，室温（22±3）℃，相对湿度50% ～ 60%，自然光照，12/12h 昼夜循环，避免强光、噪音等刺激，普通饲料喂养，自由进食饮水。本研究方案已通过柳州市中医医院（柳州市壮医医院）伦理委员会批准（批号：2022-KY-XS-023-01）。

1.2 药物与试剂

通窍活血汤配伍组成：赤芍3 g，川芎3 g，红花9 g，桃仁（研泥）3 g，大枣（去核）10 g，老葱（切碎）5 g，生姜（切片）9 g，人工麝香（绢布包）0.15 g，黄酒250 mL。制备方法：用黄酒250 mL 把赤芍、桃仁、川芎、红花、老葱、生姜、大枣等7味先煎至150 mL，去滓加入人工麝香，再煎煮使药液浓缩至100 mL，最后滤过，将滤液配制成含生药2 g/mL 溶液，最后将制好的溶液放置于4 ℃的冰箱备用。盐酸多奈哌齐片(植恩生物技术股份有限公司，规格：5 mg/片，批号：02220390，批准文号：国药准字H20010723)；Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司，批号：400209）；逆转录试剂盒（批号：05256502）定量聚合酶链式反应（RT- PCR）试剂盒（批号：05246001），购自于上海近岸科技有限公司；4%多聚甲醛通用型组织固定液（北京生命科学biosharp 公司，批号：22329929）；苏木素染液、伊红染液（北京索莱宝科技有限公司，批号均为20221214）。

1.3 主要仪器

CX41RF 型生物显微镜（日本OLYMPUS）；Morris 水迷宫（中国医学科学院药物研究所）；2-6型 Sigma 低温离心机（德国Sigma 公司）；CF16RX Ⅱ型高速低温离心机（日本Hitachi 公司）；Multiskan SkyHigh 型酶标仪（美国Thermo Scientific 公司）；HH-W21-600 型电热恒温水浴箱（上海医疗器械七厂）；YT-7FB 型生物组织摊烤片机、YB-6LF 型生物组织石蜡包埋机、ZT-12M 型生物组织自动脱水机（湖北省孝感市亚光电子技术有限公司）；Rm2235 型石蜡切片机（德国LAICA 公司）；7500 型实时荧光定量PCR 仪（美国Thermo Fisher 公司）。

2 方法

2.1 动物模型制备

使用改良2-VO 法[8]制备VD 大鼠模型：将充分麻醉后的大鼠固定在操作板上，颈前部去毛，碘伏常规消毒，沿颈部正中垂直切口（长约1.5 ～2 cm)，采用血管钳钝性逐层分离直至完全暴露双侧颈总动脉(CCA)，改用镊子将CCA 与迷走神经小心钝性分离，待双侧血管充分暴露后用无创动脉夹同时夹闭双侧CCA 以阻断大脑血流，10 min 后取下动脉夹恢复灌注，10 min 后再次进行夹闭，共反复夹闭-再通3 次后用5 - 0 号无菌手术线永久性结扎双侧颈总动脉，术毕缝合切口，庆大霉素喷洒消毒后将大鼠放回笼中，待醒后正常饲养。假手术组不进行造模操作，仅分离双侧颈总动脉，后续操作同造模组。造模后因各种不明原因死亡脱落8 只，术后出现明显活动障碍（无法正常行走及游泳）脱落4 只，均予以剔除。

2.2 动物分组

造模手术后采用 Longa 5 级评分法[9]判断神经行为学：无神经功能损伤为0 分；梗死对侧前爪伸缩困难为1 分；行走时向功能障碍侧转圈为2 分；行走时向功能障碍侧倾倒为3 分；意识障碍、完全不能行走为4 分。实验选取分值为1 ～ 3 分的大鼠入组观察。用Morris 水迷宫实验确认造模效果[10]，即以对照组大鼠的逃避潜伏期作为参考值，实验组大鼠造模后的逃避潜伏期与参考值之差与该鼠逃避潜伏期之比大于20%定为VD 大鼠。经排除造模后死亡与不符合标准的模型大鼠，最终选取48 只作为实验大鼠，随机分为四组：假手术组、模型组、西药组和中药组，每组12 只。根据动物与人体间的等效剂量换算[11]，算出盐酸多奈哌齐和通窍活血汤的大鼠临床等效剂量分别为0.5 mg/kg 和20.0 g/kg，假手术组和模型组则灌胃0.9%氯化钠溶液，使用等体积灌胃法（即1 mL/100 g）于造模后第3 天进行灌胃，每日1 次，持续30 d。

2.3 观察指标

2.3.1 定位航行与空间探索实验 将Morris 水迷宫分4 个象限，平台置于第3 象限，水位没过平台约2 cm，将大鼠头对着水迷宫壁的不同方向放入，记录大鼠逃避潜伏期时间，即入水到爬上平台的时间。若大鼠在120 s 内未找到平台，则引导大鼠爬上平台并停留10 s，逃避潜伏期时间记为120 s。每只大鼠从4 个象限随机入水，将大鼠入水后到发现平台的时间和游泳轨迹作为观察指标，每个象限各训练1 次，连续训练5 d，记录大鼠每次到达平台的时间，并计算平均值，作为大鼠定位航行实验成绩。第6 天撤去平台进行空间探索实验，记录实验大鼠120 s 内在目标象限停留时间和穿越原平台的次数，以此作为评价大鼠空间记忆能力的标准。

2.3.2 心脏灌流固定 每个实验组随机抓取5 只大鼠进行心脏灌流，用于海马组织病理观察。腹腔注射足量麻药将大鼠深度麻醉后，剪开胸廓，露出心脏，将灌注针的针头从左心房向左斜上刺入升主动脉，固定针头，剪开右心耳，迅速注射一定量0.9%氯化钠溶液直至大鼠肝脏变白、从右心耳流出的液体为透明清亮无血色，随后滴灌约250 mL 左右4%的多聚甲醛固定液，先快后慢，直到大鼠颈项强直、身体与四肢完全僵硬、眼球完全透明。灌注结束后立即将大鼠断头、冰上取脑，沿冠状面切开脑组织（厚度约2 ～3 mm），放入固定液中并置于4℃冰箱保存24 h 后行石蜡包埋切片用于HE 染色。剩余每组7 只未灌流大鼠断头、冰上取海马并将其置于- 80℃冰箱中保存。

2.3.3 苏木素-伊红染色 将固定后的大脑组织梯度乙醇脱水（70% 、80% 1h、90%1 h、95% 1 h、无水乙醇Ⅰ 1 h、无水乙醇Ⅱ 1 h）、二甲苯透明、石蜡包埋切片（切片厚度 3.5 μm），二甲苯脱蜡，梯度乙醇至水，苏木素染色，盐酸乙醇分化，伊红染色，梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在光学显微镜下观察海马CA1 区的组织形态并任意选取2 ～ 3 个视野进行摄片记录。

2.3.4 RT-PCR 检测 取剩下未灌流大鼠海马组织，采用Trizol 法进行总RNA 提取，Multiskan SkyHigh 仪器检测RNA 的浓度和纯度。按照逆转录试剂盒进行实验，反应条件：50℃ 15 min，85℃ 5 s，终止反应，冰上冷却，于-80℃保存备用。PCR 引物设计由上海生工设计完成，按照PCR 试剂盒进行操作，2×NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL，上游引物和下游引物各1μL，cDNA 模板1μL，ROX 0.4 μL，RNase Free Water 6.6 μL。反应程序为95℃预变性1 min，两步法扩增，条件为95℃ 20 s，60℃1 min，共进行40 个循环，反应完成后作熔解度曲线分析以排除非特异性扩增，GAPDH作为内参基因，运用2-ΔΔCt法计算mRNA 相对表达量。PI3K、Akt、Bad及内参基因引物的设计序列见表1。

表1 各目标基因引物的设计序列Tab.1 Design sequences of primers of each target gene

2.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件对数据进行处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 定位航行结果

造模结束后，待大鼠切口完全愈合后进行水迷宫测试。经过5 d 的定位航行训练，各组逃避潜伏期均缩短，与假手术组相比，模型组的逃避潜伏期明显延长(P＜ 0.05)，表明造模成功；经通窍活血汤和盐酸多奈哌齐灌胃干预治疗后，VD 大鼠空间学习能力均得到明显提高，其中，第1 天、第2 天、第5 天中药组平均逃避潜伏期均比西药组缩短(P＜ 0.05)，表明通窍活血汤治疗效果更显著，见表2。

表2 各组大鼠平均逃避潜伏期结果比较(s，x±s，n = 12）Tab.2 Comparison of average escape latency in each group(s，x±s，n = 12）

3.2 空间探索实验

定位航行训练结束后第2 天进行空间探索实验。与模型组相比，西药组和中药组目标象限停留时间和穿越平台次数均明显增加(P＜0.05)，说明盐酸多奈哌齐和通窍活血汤干预治疗均可以改善VD大鼠的学习记忆能力，而中药组在目标象限停留时间更长(P＜ 0.05)，说明通窍活血汤治疗效果更佳，见表3。

表3 大鼠空间探索实验结果比较(x±s，n = 12）Tab.3 Comparison of experimental results of space exploration in rats(x±s，n = 12）

3.3 HE 染色结果

光学显微镜下观察各实验组大鼠海马组织CA1区神经细胞组织形态，假手术组神经细胞结构完整，形态规则，层次清晰，排列紧密整齐，无明显的神经元丢失；中药组和西药组CA1 区神经细胞排列不十分完整，形态尚规则，排列较紧密，细胞间质可见水肿表现，神经元与周围组织间隙较宽，表明有部分神经元丢失。而模型组海马组织CA1 区神经细胞排列凌乱、疏松，组织形态十分不规则，细胞核体积变小、呈核固缩表现，神经元与周围组织间隙明显增宽，提示有大量神经元丢失，见图1。

图1 各组大鼠海马CA1 区神经元形态结构（HE，×40）Fig.1 Morphological structure of neurons in hippocampal CA1 region of rats in each group（HE，×40）

3.4 RT-PCR 实验结果

与假手术组比较，模型组PI3K、AktmRNA 表达明显下降，BadmRNA 表达明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，盐酸多奈哌齐治疗组及通窍活血汤治疗组PI3K、AktmRNA 的表达明显升高，BadmRNA的表达明显下降（P＜0.05），见表4。

表4 PI3K、Akt、Bad mRNA 相对表达量（x±s，n = 12）Tab.4 The expression levels of PI3K, Akt and Bad mRNA relative to GAPDH （x±s，n = 12）

4 讨论

VD 常继发于各种脑血管疾病，主要与脑组织缺血缺氧损伤相关，具体发病机制尚不明确。海马区作为大脑组织中与学习、记忆关系最为密切的功能区，径直参与信息的处理和储存，其神经元数量及形态改变会影响机体学习记忆功能的正常获取及储存，而海马结构和功能的完整性则与空间学习能力密切相关，神经元凋亡或丢失将会影响海马接收其他联络区域信息，从而导致学习和记忆障碍[12-13]。

本研究通过夹闭双侧颈总动脉复制VD 模型，造模后大鼠海马CA1 组织结构紊乱、排列稀疏，Bad基因表达明显升高，PI3K/Akt基因表达明显减少，表明缺血-再灌注损伤可能加速了促凋亡蛋白基因表达，抑制了抗凋亡蛋白基因的表达，造成海马神经元凋亡或丢失，导致大鼠学习、记忆功能障碍。给药干预治疗后大鼠Bad基因表达明显减少，PI3K/Akt基因表达明显升高，其机制可能与盐酸多奈哌齐和通窍活血汤激活了PI3K/Akt/Bad信号通路，促进了PI3K活化及Akt磷酸化，进而抑制凋亡信号蛋白的磷酸化或调节转录因子，加速促凋亡蛋白Badser136位点磷酸化，使之与Bcl-2 解离有关。通窍活血汤是临床上治疗VD 的常用方，方中麝香味辛、性温，具有开窍通闭、解毒活血之效，现代研究发现麝香能降低大脑中动脉闭塞模型大鼠脑组织金属蛋白酶的表达和降低大鼠血脑屏障的通透性，进而改善脑缺血损伤，发挥保护神经细胞的功效[14]；桃仁、红花、赤芍活血化瘀；川芎性温味辛，活血行气、祛风止痛；老葱通阳开窍、温经散寒；生姜、大枣则补中养血，使气血化生有源；加入黄酒同煎则活血、温经通脉之力愈胜，全方具有抗血小板聚集、抗氧化应激、抗炎、促进神经元再生等多方面脑保护作用[15]。本研究中，通窍活血汤治疗组较西药组大鼠海马区PI3K/Akt基因表达升高更明显，Bad基因表达下降更显著，海马区组织形态结构更完整，大鼠学习记忆功能恢复更明显，治疗效果更佳，与本课题组前期临床研究结果一致[16-20]。综上说明，通窍活血汤可上调PI3K/Akt基因表达、下调Bad基因表达，通过调控PI3K/Akt/Bad信号通路，发挥抗细胞凋亡作用，改善VD 大鼠的认知功能。

5 结论

通窍活血汤可改善VD 大鼠学习、记忆功能，降低海马组织细胞结构病理损害，修复受损神经元细胞，这可能与PI3K活化，促进Akt磷酸化，激活PI3K/Akt/Bad信号通路，使抗凋亡因子升高，减少促凋亡因子的表达有关。本实验采用改良2-VO 法复制VD 模型，相较于传统2-VO 法，避免了因突然夹闭造成大脑急性缺血-低灌注损伤引起脑组织水肿造成大鼠死亡，同时弥补了单纯夹闭-再通可能使大鼠脑组织缺血坏死面积不够大而影响造模成功率的不足，但本研究中未能对相关蛋白的表达含量与神经凋亡细胞进行检测，实验结果具有一定的局限性，未来可进一步检测通路相关蛋白的表达，计算海马神经细胞凋亡率，为临床用药提供更可靠依据。