基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术分析通窍活血汤化学成分

卢广英，韩冰冰，刘洋洋，娄 原，马 柯，王世军，王 媛

（山东中医药大学，山东省中医经典名方协同创新中心，山东 济南 250355）

通窍活血汤出自清代王清任的《医林改错》，由赤芍、川芎、桃仁、红花、生姜、葱、大枣、麝香等8 味药物构成，具有活血通窍之功，可抗炎、抗氧化、改善脑微循环、抑制脑细胞凋亡，临床广泛用于治疗缺血性脑卒中[1]、颅脑损伤[2]、血管性痴呆[3]等疾病，尤善治疗脑缺血再灌注损伤，其机制可能是通过促进星形胶质细胞活化，调节星形胶质细胞谷氨酸-谷氨酰胺循环，降低谷氨酸兴奋性毒性来改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能[4]。

通窍活血汤作为活血化瘀类经典名方，临床疗效显著，但其化学成分尚未系统分析，且无明确质量评价指标，化学物质组成不明确，制约了其药效物质基础的深入研究及质量控制指标的确定。本实验采用超高效液相色谱-飞行时间串联质谱法（UPLC-Q-TOFMS/MS）对通窍活血汤的化学成分进行系统分析与鉴定，以期为其质量控制及药效物质基础研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1290 型超高效液相色谱仪（DAD 检测器）、Agilent Q-TOF 6545 型LC/MS 高分辨串联质谱（美国安捷伦科技公司）；ME104 型电子分析天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；KQ-300 BD 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 材料

赤 芍（ 批 号：2107290152）、 川 芎（ 批 号：2108050093）、桃仁（批号：2103280472）、红花（批号：2108230012）均购自亳州市沪谯药业有限公司；生姜（批号：20210909）购自山东泽莹商贸有限公司；葱（批号：201213）购自河北宏济堂药业有限公司；大枣（批号：19040701）购自山东博康中药饮片有限公司；麝香（批号：19052701）购自山东省药材有限公司。经山东中医药大学刘红燕副教授鉴定，均符合2020 年版《中国药典》（一部）有关规定。乙腈、甲醇、甲酸为质谱纯（德国Merck 公司）；纯净水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

对 照 品 芍 药 苷（ 批 号：M28GB143089）、 熊果酸（批号：C15O11Q126879）、绿原酸（批号：A22GB158496）、棕榈酸（批号：M02D11K133109）均购自上海源叶生物科技有限公司；洋川芎内酯 A（批号：C14082262）、木兰花碱（批号：C14975194）均购自上海麦克林生化科技股份有限公司；山柰酚-3-O- 芸香糖苷（批号：ST08020120）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；所有对照品质量分数均大于 98%。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1mm ×100 mm, 1.8 μm)，流动相：乙腈（A） - 0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0 ～ 5 min，5%A；5 ～ 20 min，5% →10%A；20 ～ 40 min，10% →15%A；40 ～ 60 min，15% →25%A；60 ～ 70 min，25% →27%A；70 ～ 90 min，27% →37%A ；90 ～ 115 min，37% →47%A；115 ～ 145 min，47% →55%A；145 ～ 155 min，55% →70%A；155 ～ 170 min，70%→95%A），柱温：30℃，流速：0.3 mL/min；进样量：5μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源采用正负离子扫描模式，雾化气体为氮气，扫描范围m/z为50 ～1 700，干燥气温度为320 ℃，干燥气流速为8 L/min，鞘气温度为350 ℃，鞘气流速为11 L/min，毛细管电压为4 000 V，喷嘴电压为1 000 V，裂解电压为175 V，锥孔电压为60 V，碰撞能量为40 eV。数据采集软件为Agilent Q-TOF 6545 LC/MS，数据处理软件为Qualitative Analysis。

2.3 供试品溶液的制备

根据《医林改错》中通窍活血汤的药物组成及配伍比例并结合课题组前期实验研究[4]，按比例称取赤芍3 g，川芎3 g，桃仁9 g，红花9 g，老葱6 g，生姜9 g，大枣七枚约21 g，置于5 000 mL 圆底烧瓶中，精密加入10 倍量75%乙醇，摇匀，浸泡1 h，回流提取2 h，过滤，滤渣再加入8 倍量75%乙醇，回流提取1 h，过滤，合并两次滤液，浓缩至无醇味，滤液减压浓缩成适宜浓度，加入麝香0.15 g，用黄酒溶解并稀释定容成 1 g/mL 的储备液。精密移取储备液1 mL，置5 mL 容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，离心（12 000 r/min）5 min，取上清液，即得。

2.4 对照品溶液的制备

精密称取对照品山柰酚-3-O- 芸香糖苷、芍药苷、熊果酸、绿原酸、棕榈酸、洋川芎内酯 A 和木兰花碱各1 mg，分别加 50%甲醇溶解并定容于1 mL容量瓶，得对照品母液，4℃ 冷藏备用。分别精密吸取适量对照品母液，50%甲醇稀释并定容至5 mL 容量瓶，得对照品溶液，用 0.22 μm 微孔滤膜过滤，备用。

2.5 数据处理分析

通过PubChem 在线数据库、SciFinder、中国知网数据库检索，收集通窍活血汤组方中7 味中药所含成分的分子式、中英文名称、准分子离子及特征碎片离子等信息，建成Excel 格式质谱数据库。采用Qualitative Analysis 分析软件，根据分子式计算出精确质量数及可能的准分子离子质荷比，并以此对采集的质谱数据进行峰提取，与PCDL Manager B.07.00 数据库中的对照品的准分子离子质荷比、特征碎片离子质荷比以及文献中的裂解规律进行比对分析，对样品中的化合物进行快速鉴定，确认推断成分。无法获得对照品的化合物，先依据 MS/MS 碎片信息，计算出每一个二级碎片的元素组成，推测其裂解方式，再解析化合物结构。

3 结果与分析

3.1 结果

采用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术对供试品溶液进行正、负离子全扫描，获得正、负离子模式下的BPI图见图1。

图1 正、负离子模式下通窍活血汤基峰离子流图Fig.1 BPC of Tongqiao Huoxue decoction in ESI+ and ESl-

采用 Qualitative Analysis 分析软件，对正、负离子模式下采集的通窍活血汤样品提取离子流 (BPC)，根据一级质谱信息，确定化合物的分子量和分子式，并通过参考 SciFinder、PubChem 数据库、中国知网数据库、文献报道以及化合物的二级质谱数据信息进行鉴定，共鉴定出55 个化合物，结果见表1。

表1 通窍活血汤 UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析Tab.1 UPLC-Q-TOF-MS/MS analysis results of Tongqiao Huoxue decoction

3.2 化学成分鉴定

3.2.1 黄酮类化合物 通窍活血汤中的黄酮类化合物主要来源于红花、大枣、桃仁等，从通窍活血汤中共鉴别出 15 个黄酮类化合物，包括化合物7、8、11、14、16、18、19、20、24、26、28、29。对于黄酮类化合物而言，它的 A、B 环上常有甲氧基、甲基等官能团，且常与糖结合成苷类，故在质谱的高能碰撞中，糖苷键的断裂、RDA 裂解、CO、CO2等中性离子的丢失是黄酮类化合物的主要裂解方式。

以化合物24 为例，在负离子模式下，由一、二级质谱数据可知m/z593.147 6 为[M-H]-峰，软件拟合分子式为 C27H30O15，二级质谱有m/z285.040 4[M-H-Glc-Rha]-、m/z255.029 5[M-H-Glc-Rha-CO-2H]-、151.003 2[[M-H-Glc-Rha-C8H6O2]-等 碎 片 离子。对照文献[5-6]及化合物质谱信息，确定为山柰酚-3-O- 芸香糖苷。

3.2.2 萜类化合物 通窍活血汤中的萜类化合物主要来源于赤芍、大枣、红花等。从通窍活血汤中共鉴别出 13 个萜类化合物，包括化合物10、13、21、33、35、40、41、44、47、48、49、51、52。主要为蒎烷型单萜苷类（化合物 10、13、21、33、35）和三萜类（化合物 40、41、44、47、48、49、51、52）。

蒎烷型单萜苷类化合物在质谱裂解中常丢失 H2O和 CH2O 分子，或失去糖基分子，在过程中常伴随着分子重排裂解，以麦氏重排多见，且裂解方式受功能基的影响较大，常出现失去苯甲酸（BA）的离子碎片，该类化合物在负离子模式下主要以[M-H+HCOOH]形式存在，少数以[M-H]-形式存在。在二级质谱中，母离子[M-H+HCOOH]-易失去1 分子BA，形成[MH-122]-、m/z121 [BA-H]-的特征碎片离子。

以化合物13 为例，在负离子模式下，由一、二级质谱数据可知m/z525.161 4 为[M+HCOOH-H]-峰，软件拟合分子式为C23H28O11，m/z479.161 4为[M-H]-峰， 二 级 质 谱 有m/z327.108 5[M-HHCHO-C7H6O2]-、m/z165.054 7[M-H-HCHO-C7H6O2-C6H10O5]-、m/z121.029 6[M-H-C16H22O9]+、m/z77.039 5[M-H-HCHO-C15H20O8-CO2]-等碎片离子。对照文献[7-8]及化合物质谱信息，确定为芍药苷。

三萜类化合物常游离存在或以与糖结合成酯或苷的形式存在，故其质谱裂解规律多为糖苷键的断裂，裂解过程中可能会丢失1 个或多个H2O、CO2、或糖基分子等，来源于大枣和赤芍饮片。

以化合物49 为例，在负离子模式下，由一、二级质谱数据可知m/z455.351 7 为[M-H]-峰，软件拟合分子式为C30H48O3，二级质谱有m/z407.329 5[M-HCOO-H4]-等碎片离子。对照文献[9-10]及化合物质谱信息，确定为熊果酸。

3.2.3 生物碱类化合物 通窍活血汤中的生物碱类化合物主要来源于大枣、红花等。从通窍活血汤中共鉴别出6 个生物碱类化合物，包括化合物12、15、31、32、34、36，主要为季铵型生物碱（化合物12、15）和亚精胺类生物碱（化合物31、32、34、36）。质谱裂解规律主要为丢失母核侧链的OH、CH3、OCH3以及逐级脱去-CH2、-CH、-C2H2、-CH2O2、-C2H4O2和-C3H6O2等形成碎片离子。此外还可发生吡啶环的α 裂解。

以化合物12 为例，在正离子模式下，由一、二级质谱数据可知m/z342.170 1 为[M]+峰，软件拟合分子式为C20H24NO4+，二级质谱有m/z297.111 6[M-C2H7N]+、282.088 2[M-C2H7N-CH3]+、265.085 0[M-C2H7N-CH3-OH]+、250.061 5[M-C2H7N-CH3-OHCH3]+、237.089 9[M-C2H7N-CH3-OH-CO]+、222.066 9[M-C2H7N-CH3-OH-CO-CH3]+等碎片离子。对照文献[11-12]及化合物质谱信息，确定为木兰花碱。

3.2.4 苯肽类化合物 通窍活血汤中的苯肽类化合物主要来源于川芎等。从通窍活血汤中共鉴别出5 个苯肽类化合物，包括化合物22、23、37、38、45。苯肽类化合物在质谱裂解中时易侧链断裂脱烯（CnH2n）和开环脱水再脱羰（H2O+CO）。

以化合物37 为例，在正离子模式下，由一、二级质谱数据可知m/z193.122 3 为[M+H]+峰，软件拟合分子式为C12H16O2，二级质谱有m/z165.068 7[M+HC2H4]+、m/z105.069 2[M+H-H2O-CO-C3H6]+、m/z91.053 8[M+H-H2O-CO-C3H6-CH2]+、m/z77.038 1[M+H-CH2]+等碎片离子。对照文献[13-14]及化合物质谱信息，确定为洋川芎内酯A。

3.2.5 酚类化合物 通窍活血汤中的酚类化合物主要来源于桃仁、红花、赤芍、生姜等。从通窍活血汤中共鉴别出 5 个酚类化合物，包括化合物3、4、5、9、42。酚类化合物在质谱裂解中易丢失 H2O、COOH、CO2、CO、CH 等，从而产生相应的特征碎片离子峰。

以化合物5 为例，在负离子模式下，由一、二级质谱数据可知m/z353.087 6 为[M-H]-峰，软件拟合分子式为C16H18O9，二级质谱有m/z191.055 7[M-H-C9H6O3]-、m/z173.044 9[M-H-C9H6O3-H2O]-、m/z127.038 7[M-H-C9H6O3-H2O-CO]-、m/z85.029 0[M-H-C9H6O3-H2O-CO-H2O-C2]-、m/z59.013 3[M-HC9H6O3-H2O-CO-C4H4O]-等碎片离子。对照文献[15]及化合物质谱信息，确定为绿原酸。

3.2.6 脂肪酸类化合物 通窍活血汤中的脂肪酸类化合物主要来源于桃仁等。从通窍活血汤中共鉴别出 5 个脂肪酸类化合物，包括化合物39、46、50、53、54。脂肪酸类化合物结构包含脂肪链和羧基或酯基基团，容易发生α-裂解产生[M-H-CO]-、[M-HCO2]-、[M-H-H2O]-、[M-H-COOH]-、[M-H-CH]-、[M-H-CH2]-等类型的特征碎片离子。脂肪酸类化合物主要由 Compound Discoverer 3.0 软件推测得到。

以化合物53 为例，在负离子模式下，由一、二级质谱数据可知m/z255.232 2 为[M-H]-峰，软件拟合分子式为C16H32O2，二级质谱有m/z237.024 8[M-H-H2O]-、m/z140.995 8[M-H-C5H10COOH]-等碎片离子。对照文献[16]及化合物质谱信息，确定为棕榈酸。

3.2.7 其他类化合物 通窍活血汤还鉴别出了糖类、核苷类、苷类、鞣质、聚炔类、酰胺类等6 个化合物，分别为蔗糖（1）、环磷酸腺苷（2）、苦杏仁苷（6）、1,2,3,4,6-O- 五没食子酰葡萄糖（27）、1,3-Diacetoxy-4,6,12-tetradecatriene-8,10-diyne（43）、芥酸酰胺（55）。

4 讨论

通过参考 SciFinder 和中国知网数据库、文献报道以及化合物的保留时间、精确准分子离子峰和二级质谱碎片等信息，初步鉴定并推测出55 个化合物，包括黄酮类15 个、萜类13 个、生物碱类6 个、苯肽类5 个、酚类4 个、脂肪酸5 个，此外还有少数其它类型化合物，并对化合物的药材来源进行了归属。对于部分化合物存在同分异构体的情况，需采用对照品及NMR 等技术手段进一步验证。正、负离子流图显示，仍存在一些响应值较高但未鉴定出的成分，这些成分还有待于进一步分离鉴定。因通窍活血汤中麝香药材的成分麝香酮为挥发性成分，故本实验未能用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术检测出麝香药材中的成分，后续将采用GC-MS 技术等进行深入研究。

方中的黄酮类化合物主要来自红花、桃仁，红花中的羟基红花黄色素A 和羟基红花黄色素B 可通过调节沉默调节蛋白1 信号通路，减轻氧化应激和细胞凋亡，对脑缺血再灌注损伤起到保护作用[30]，桃仁中的柚皮素可通过抑制炎症因子分泌，减轻创伤性颅脑损伤后过度炎性反应[31]，萜类化合物主要来自赤芍和大枣，赤芍中的芍药苷可通过激活 LKB1/AMPK 信号通路对急性脑梗死大鼠神经损伤起到保护作用[32]，大枣中的三萜酸类化合物具有抗氧化、保肝作用[33-34]，川芎中的苯酞类化合物具有抗氧化损伤、抗动脉粥样硬化、抗凝血、抗炎、抗脑缺血再灌注损伤的药理作用，广泛用于治疗缺血性脑卒中、骨关节炎[35-36]等，桃仁中的苦杏仁苷及脂肪酸类化合物具有心脑血管保护、抑制动脉粥样硬化、抗肿瘤作用[37-38]，生姜中的姜辣素类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎作用[39]。这些物质可能为通窍活血汤的药效物质基础。

5 结论

本实验采用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术，快速全面地对通窍活血汤中的化学成分进行了初步定性分析，并对所有化学成分进行了药材来源归属，方法稳定可靠，为进一步对通窍活血汤的入血成分分析做准备，也为深入研究该方的药效物质基础及其作用机制和质量控制提供了理论依据。