基于SPME-GC/MS 技术鉴别三种南五味子属药材

陈明权 ，商雪莹，覃仁安，何风雷，农根林，杨永成

（广州白云山陈李济药厂有限公司，广东 广州 510288）

黑老虎、地血香、红木香均为木兰科南五味子属常用的三种中药材，分别为南五味子属植物厚叶五味子Kadsura coccinea(Lem.)A.C.Smith.，异型南五味子Kadsura heteroclita(Roxb.) Craib 和长梗南五味子Kadsura longipedunculataFinet et Gagnep的干燥根[1-3]。因其属于同科同属药材，不仅外观性状有较高的相似性，且具有祛风、行气、止痛等功效，化学成分也以木脂素、三萜类化合物为主[1-3]，但三者不可代替使用。其中，黑老虎为中华跌打丸、壮腰健肾丸等中成药的原料药材，红木香为当归赤芍汤、经验秦艽汤等中医经典方剂的重要药味，而在市场流通领域，有黑老虎、地血香、红木香三者混用的情况出现。

目前，关于南五味子属药材的研究，主要集中在生物学特性、化学成分及药理药效等方面[4-7]。虽然南五味子属药材挥发油成分研究也有相关文献[8-13]报道，但其采用的提取方法均为传统的水蒸气蒸馏法，且未见南五味子属类药材鉴别研究的报道。因此，本试验将采用固相微萃取结合气相色谱质谱联用技术（SPME-GC/MS）对上述三种药材的挥发性成分进行研究，通过相关性分析与聚类分析，达到区分黑老虎、地血香、红木香三种药材的目的，为南五味子属药材的鉴定与质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

TQ 8040N 型气相色谱-质谱联用仪（日本岛津公司）；75 μm PDMS/DVB 型固相微萃取仪-纤维头（灰色），25 mL SPME 专用采样瓶（美国SUPELCO公司）；BS110S型电子分析天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试验样品

本研究将样品分别编号为S1 ～ S15，均为采集于野生环境的药用植物的根。其中，样品S1 ～ S9 经广州中医药大学中药鉴定教研室主任黄海波副教授鉴定为木兰科南五味子属植物厚叶五味子Kadsura coccinea(Lem.)A.C.Smith.的干燥根，即药材“黑老虎”，样品S10 ～ S13 经鉴定为木兰科南五味子属植物异型南五味子Kadsura heteroclita(Roxb.) Craib 的干燥根，即“地血香”；样品S14 ～ S15 经鉴定为木兰科南五味子属植物长梗南五味子Kadsura longipedunculataFinet et Gagnep 的干燥根，即“红木香”，样品信息详见表1。

表1 15 批样品信息Tab.1 15 batches of sample information

1.3 数据处理

样品挥发性成分通过质谱数据NIST14 数据库进行鉴定，按峰面积归一化法计算出各挥发性成分的相对百分含量，并采用SPSS 19.0 统计学软件对各样品进行相关性与聚类分析。

2 方法与结果

2.1 供试品制备

称取0.50 g 样品粉末（过10 目），置于25 mLSPME 专用萃取瓶中，在80 ℃砂浴锅中平衡10 min，将SPME 萃取纤维直接插入萃取瓶中，萃取30 min；然后将SPME 插入GC 进样口，230℃ 解吸3 min 进样。

2.2 GC 色谱条件

采用安捷伦 HP-5 MS（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）色谱柱，载气为高纯氮，流速为1.0 mL/min，进样口温度为230℃，分流比为50 : 1；采用程序升温模式，柱初始温度为50℃，保持2 min；以5℃/min 的速率升至100℃，保持2 min；以2℃/min 的速率升至130℃，保持10 min；以2℃/min 的速率升至180℃，保持2 min。

2.3 MS 质谱条件

离子源温度为230℃；电子能量为70 eV；扫描质量范围(m/z)为20 ～600 。

黑老虎药材及其同属品种的样品GC/MS 总离子流图，见图1。

图1 三种药材GC/MS 总离子流图Fig.1 GC/MS total ion current diagram of three medicinal materials

2.4 方法学考察

2.4.1 重复性试验 精密称取同1 供试样品（S2）6 份，按“2.1”项下方法制备供试品，按“2.2”“2.3”项下条件进行分析，测得各挥发性成分峰面积积分值，计算参考峰（S）的相对百分含量及其相对标准偏差，结果显示，该参考峰的RSD 为2.38%，表明方法重复性良好。

2.4.2 稳定性试验 精密称取同1 供试样品（S2），分别在0、2、5、9、17、24 h，按“2.1”项下方法制备供试品，并按“2.2”“2.3”项下条件进行分析，测得各挥发性成分峰面积积分值；计算参考峰（S）的相对百分含量及其相对标准偏差。结果，该参考峰的RSD 为2.76%，表明供试品在24 h 内稳定。

2.5 样品测定结果

15 个试验样品，按“2.1”项下方法制备供试品，按“2.2”“2.3”项下条件进行分析，测得的质谱数据与NIST14 数据库进行匹配，各成分的匹配度＞80；根据各挥发性成分峰面积积分值，计算各成分的相对百分含量，三种南五味子属药材共检出74 个挥发性成分，其中，黑老虎样品中相对含量较高的成分为β-石竹烯（17.85% ～ 44.24%）、a-蒎烯（6.54% ～10.08%）、δ-杜松烯（2.22% ～ 9.87%）、α-律草烯（2.54% ～ 5.68%），地血香的则为δ-杜松烯（6.61% ～17.06%）、左旋龙脑（2.08% ～ 8.40%）、T-杜松醇（4.29% ～ 24.61%）、a- 蒎烯（4.49% ～ 9.05%），红木香的则为1，2，3，5，6，8a-六氢-4，7-二甲基-1-(1-甲基乙基)萘（9.97% ～ 17.78%）、4-萜品醇（8.83% ～ 8.90%）、1-乙酸冰片酯（3.79% ～ 8.63%）、δ-榄香烯（6.20% ～ 9.21%），以上结果表明三种南五味子属药材之间的挥发性成分存在明显差异。此外，三种南五味子属药材挥发性成分中存在共有成分31 个（见表2），表明三者之间也存在一定相似性。

表2 31 种共有成分相对百分含量测定结果（n = 2）Tab.2 Determination results of relative percentage content of 31 common components (n = 2)

2.6 相关性分析

采用SPSS 19.0 对15 个样品中31 种共有成分的相对百分含量为数据进行Pearson 相关性分析，结果显示，黑老虎、地血香、红木香三种南五味子属药材种内的Pearson 相关系数范围分别为0.741 ～0.997、0.520 ～ 0.862、0.815；对于其品种之间的相关性而言，黑老虎与地血香样品之间的Pearson 相关系数均≤0.381，黑老虎与红木香样品之间相关系数均≤0.097，地血香与红木香样品之间相关系数均≤0.267，即种内Pearson 相关系数均远大于种间。表明南五味子属药材种内的差异性较小，而种间的差异性较大。

2.7 聚类分析

运用 SPSS 19.0 软件对表2 中15 个样品31 个共有成分的相对百分含量为数据进行聚类分析，采用组间联接分析法，以Pearson 相关性系数作为样品相似度的距离公式，结果见图2。当判断距离为15 时，结果显示15 个样品被分为三类：第Ⅰ类黑老虎为（S1 ～S9），第Ⅱ类为地血香（S10 ～ S13），第Ⅲ类红木香为（S14 ～ S15）；即黑老虎归为一类；地血香归为一类；红木香归为另外一类。

3 讨论

3.1 GC 升温程序的优选

本研究比较了以下四种升温程序：① 柱初始温度为50 ℃，保持2 min；以9 ℃/min 的速率升至140 ℃，保持3 min；以2 ℃/min 的速率升至240 ℃，保持3 min。② 柱初始温度为50 ℃，保持2 min；以2 ℃/min的速率升至110 ℃，保持2 min；以3 ℃/min 的速率升至240 ℃，保持2 min。③ 柱初始温度为60 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 的速率升至100 ℃，保持2 min；以2 ℃/min 的速率升至230 ℃，保持2 min。④ 柱初始温度为50 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 的速率升至100 ℃，保持2 min；以2 ℃/min 的速率升至130 ℃，保持10 min；以2 ℃/min 的速率升至180 ℃，保持2 min。结果显示，第④种升温程序所测得的色谱峰数量最多，分离效果好且时间短，因此，本研究选择第④种升温程序作为最佳的GC 升温程序。

3.2 SPME 萃取条件的优选

本研究采用单因素试验方法，考察不同萃取温度（60、80、100、120 ℃）、不同萃取时间（15、30、45 min）及不同取样量（0.25、0.50、1.0 g）对黑老虎挥发性成分的影响，从而筛选出最佳的萃取条件。结果显示，在萃取温度方面，四个萃取温度所测得的色谱峰个数基本一致，但主要色谱峰的分离度大小依次为80 ℃、100 ℃、60 ℃、120 ℃，表明最佳的萃取温度为80 ℃；在萃取时间方面，主要色谱峰的响应值大小依次为30、45、15 min，表明最佳的萃取时间为30 min；在取样量方面，不同取样量对应的色谱峰响应值大小依次为0.50 g、1.0 g、0.25 g，从节约样品量的角度出发，本研究选择0.50 g 作为最佳的取样量。

与常用的挥发性成分提取技术相比，固相微萃取技术具有小型化、操作简单、高通量、用时短及溶剂消耗低的特点，既克服了水蒸气蒸馏法提取温度过高而破坏挥发性成分的缺陷，又避免了超临界萃取技术成本高而无法普及的问题[14-15]。因此，本研究对固相微萃取条件参数进行优化，充分提取样品中的挥发性成分，以适用于南五味子属药材。

3.3 药材特征性成分的确定

梁海玲等[16]采用SPME-GC/MS 方法对番石榴果实的挥发性成分进行了研究，结果显示其主要成分为β-石竹烯（7.34%）、a-蒎烯（2.61%），与具有“嚼碎有生番石榴味”特征的黑老虎中主要挥发性成分（β-石竹烯17.85% ～ 44.24%、a-蒎烯6.54% ～10.08%）结构相似，提示β-石竹烯、a-蒎烯可作为黑老虎的特征性成分，同时考虑到a-蒎烯在地血香中的相对百分含量也高达4.49% ～ 9.05%。因此，可确定将成分β-石竹烯作为区分黑老虎与地血香、红木香的依据。地血香药材中存在具有“嚼碎有清凉感”气味特征对应的挥发性成分左旋龙脑（2.08% ～8.40%），因此，也可以将其作为区分地血香与黑老虎、红木香的特征性成分。

4 结论

本研究建立的SPME-GC/MS 方法较全面地反映了木兰科南五味子属药材的挥发性成分，分析方法简便、准确、可靠。通过聚类分析以及特征性成分β-石竹烯和左旋龙脑可以有效区分黑老虎、地血香与红木香三种药材，为南五味子属药材的真伪鉴别提供了一种新的方法。