减施氮肥配接种固氮菌剂对烤烟生长和土壤特性的影响

滕秋梅　张德楠　余丽敏　何成新　张中峰　徐广平

摘要：目前多数经济作物种植过程中存在氮肥用量过多成效甚微的问题。为探讨减少氮肥用量且施加固氮菌剂对烤烟生长及土壤特性的影响，设置减半氮肥（对照CK）、施全量氮肥（T2）、减半氮肥配接种固氮菌剂（T3）共3个处理，通过盆栽试验，分析减氮配施固氮菌对不同品种烤烟农艺性状、生物量、叶片养分含量、土壤化学性质和土壤微生物的影响。结果表明，T2、T3处理下烤烟的株高、茎粗、叶长、叶生物量、总生物量差异不显著。叶片全氮、全磷、全钾含量均表现为T2＞T3；土壤全磷、全钾、速效磷和碱解氮含量在T2和T3处理间没有显著差异。土壤细菌、放线菌数量均表现为T3＞T2，真菌数量则表现为T2＞T3，其中NC102、KRK26在T3处理下细菌数量比T2分别多44.77%、22.65%；放线菌的数量分别多33.81%、31.77%；真菌数量比T2分别少19.28%、15.54%。经过主成分分析得出，土壤有机碳、全氮、全磷、细菌与叶片全钾、全氮、全磷、株高、叶长、叶宽、茎生物量等均显著正相关，说明不同烤烟在不同处理下的农艺性状、生物量、叶片养分含量、土壤化学性质、土壤微生物数量之间具有显著的相关关系。可见，减氮配施固氮菌菌剂对不同品种烤烟的影响与全量施氮相似，减氮配施固氮剂可显著改善烤烟生长的土壤微环境。

关键词：减氮；固氮菌剂；烤烟；生长；土壤特性

中图分类号：S143.1；S572.06文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）21-0072-07

目前我国在大多数作物种植过程中普遍存在氮肥使用量高、利用率低的问题［1］。化肥尤其是氮肥的过量施用会导致土壤板结酸化、氮淋失、水土流失、土壤微生物生物量下降和潜在的大气污染等环境问题和生态危机［2-3］。针对当前化肥超量使用在农业生产中的现状，有机肥替代化肥是改善措施之一。施用大豆和海藻等有机肥，可以改善作物土壤的理化性质，并能影响土壤细菌群落结构以及作物生长发育［4］。除用有机肥代替化肥外，Tao等聚焦于将微生物菌剂应用于提高肥料利用效率和促进农作物生长［5］。微生物菌剂的施用可提高土壤营养成分含量，增加微生物的多样性；它所产生的某些代谢产物可以刺激植株根系生长，帮助植株更好地摄取养分，从而促进作物生长［5-7］；同时可以在一定程度上减少氮肥的用量，避免对环境的污染［8］。林丽云等认为，化肥配施微生物菌剂对作物的生长有显著的影响［9］。李凤霞等认为，氮肥减量30%配施微生物菌剂可使土花椰菜产量明显增加［10］。其中固氮菌作为一种有机营养型细菌，在作物增产、土壤环境改善、生物固氮等问题上具有重要作用［11-13］。胡梦媛等认为，固氮菌与化肥配施可以使作物产量增加20％以上［14］。贾雨雷等认为，化肥菌草固氮菌肥+75%化肥在一定程度上可以促进巨菌草生长，改善其营养品质和土壤理化性质［15］。以上结果均表明，有机肥和微生物菌剂的合理配置在促进作物生长和提高产量以及减少化肥用量上表现出巨大的潜力和良好的应用前景。烤烟是一种以质量为主兼顾产量的特殊叶用经济作物。烤烟在栽培过程中对氮素营养非常敏感，氮含量直接影响植株的生长发育、干物质积累等重要生理生化过程，对烟株体内重要的有机物如蛋白质、叶绿素、烟碱等的含量也有显著影响，进而影响烤烟的品质［16-18］。有关施用有机肥、不同水平氮肥或接种微生物菌剂配施化肥对烤烟生长、产质量、抗病性以及植烟土壤理化性质等影响的研究较多［4，19-22］。但针对氮肥与固氮菌剂的联合使用对不同品种烤烟生长状况、叶片营养含量、土壤化学性质及土壤微生物特性等方面的系统研究仍处在初级阶段。本研究利用盆栽试验，使用固氮菌（巨大芽孢桿菌）接种烤烟，探讨以有机肥为底肥，氮肥减量配接种固氮菌剂条件下对烤烟的生长、叶片营养含量、土壤化学性质及土壤微生物的影响，讨论在减少氮肥用量的条件下固氮菌和有机肥替代化肥能否满足烤烟对氮素的营养需求，旨在为化肥减量施用、固氮菌剂在农业中的应用与推广以及农业可持续发展提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烤烟有NC102和KRK26共2个品种，来自广西中烟工业有限责任公司邵阳烟叶基地。供试的固氮菌为巨大芽孢杆菌，从广西壮族自治区平果市果化镇石漠化地区植物根际土壤中分离筛选所得，具体筛选方法参照曹彦强等的做法［23］。供试肥料：氮肥为硝酸铵；磷钾肥为磷酸二氢钾（执行标准：HG/T 2321—2016《肥料级磷酸二氢钾》；P2O5≥51.5%、K2O≥34%）；有机肥即草炭灰（有机质含量>50%，氮含量2%）。供试盆栽土壤采自中国科学院广西植物研究所试验田，土壤pH值、有机碳含量、全氮含量、全磷含量、全钾含量、速效磷含量、速效钾含量、交换性钙含量、交换性镁含量、碱解氮含量分别为5.27、32.99 g/kg、1.30 g/kg、0.60 g/kg、9.62 g/kg、1.23 mg/kg、5.07 mg/kg、209.59 mg/kg、18.60 mg/kg、83.81 mg/kg。

为模拟自然状态下的接种环境，试验土壤不进行灭菌。盆栽试验所用容器为塑料花盆（规格为 28 cm×32 cm）。

1.2 试验设计

试验于2020年4月在中国科学院广西植物研究所进行。该地区年平均相对湿度73%～79%，日照时长1 670 h、温度19.3 ℃。试验采用完全随机设计，共包括3个处理，分别为施50%大田推荐剂量即7.5 g氮肥的对照处理（CK），施全量大田推荐剂量15 g氮肥（T2），施50%大田推荐剂量即7.5 g氮肥配合100 mL固氮菌剂（T3）［24］。每个处理设置5个重复，2种烤烟共计30盆。

试验花盆使用0.5% KMnO4溶液浸泡3～5 min 消毒，而后清洗干净，待自然风干后装填由 1 kg 土（上层）、1.5 kg草木灰（中层）、1 kg土（底层）组成的培养基质（基质高约为花盆高度的3/4），以80%最大田间持水量为标准加水至培养基质中，平衡1 d后每个花盆移植1株烤烟进行适应性生长。待烤烟长至有5～6张真叶时，在苗根际打孔，接种菌剂（将筛选纯化的巨大芽孢杆菌菌株接种至 LB 液体培养基中，摇床培养（30 ℃、180 r/min）至对数期。用注射器进行灌根接种，接种量为100 mL，使最终浓度达到106 CFU/g。接种10 d 后，在植物根部以浇灌的方式施加肥料。控制肥料比例为 N ∶P ∶K=1 ∶1 ∶2.5［24］，T2处理组施加氮肥15 g、磷酸二氢钾30 g。T1、T3处理对应的减氮（1/2氮）处理的施氮量为7.5 g/株，各处理磷、钾肥用量一致，即每株磷酸二氢钾均为30 g，分3～4次施加。

1.3 测定指标及方法

烤烟移栽后90 d，每个处理选择生长状况较一致的3株烤烟，用钢卷尺和游标卡尺测定烤烟茎粗（茎基部直径）、株高（茎基部至生长点上方的高度）、叶长（叶子为中成熟叶）和叶宽；采用收获法测定生物量。于烤烟成熟期采取植株样品，将采集的烟株按不同器官（根、茎、叶）分开，分别称鲜质量后装信封袋，置于烘箱内烘至恒质量，称量各部位干质量，最后取3株烤烟的平均值。用粉碎机将烘干的样品粉碎后过筛。植物全碳、全氮、全磷、全钾含量的测定分别采用重铬酸钾氧化-外加热法、凯氏定氮法、钼锑抗比色法、火焰光度法，全钙和全镁含量均采用络合滴定法测定［25］。

采植物样的同时采集花盆里的土壤（移栽后130 d）。清除地被物后用土钻取0～10 cm的土 300 g，剔除石砾和植物残根等杂物后迅速装入灭菌的采样袋中。带回实验室后过2 mm筛，一部分样品立即进行土壤微生物数量测定；另一部分样品自然风干后用于土壤养分的测定。土壤pH值采用pH计测定，土壤有机碳、全氮、全磷、速效磷、全钾、速效钾含量的测定分别用重铬酸钾氧化-外加热法、用半微量凯式法、氢氧化鈉碱熔-钼锑抗比色法、双酸浸提法、氢氧化钠碱熔-火焰光度法、用乙酸铵浸提-火焰光度法［25］。土壤微生物数量的测定参照许光辉等的方法进行［26］，通过稀释平板计数法进行细菌、放线菌、真菌数量的测定，采用的培养基分别为牛肉膏蛋白胨培养基、改良高氏1号（苯酚 500 mg/L）培养基、马丁（Martin）孟加拉红-链霉素（链霉素30 mg/L）培养基。

1.4 数据处理

采用SPSS 22.0软件统计分析，使用ANOVA单因素方差分析、Duncans检验和最小显著性差异（LSD）法对同一品种烤烟不同处理间的植物和土壤化学性质进行显著性分析与多重比较（α=0.05）；同一处理不同烤烟品种间的差异采用配对t检验进行分析。用Origin 2018作图；图和表中的数据为3个重复的平均值和标准误差；以植物的农艺性状、叶片营养物质含量、土壤化学性质和土壤微生物指标通过CANOCO 5.0软件完成PCA分析。

2 结果与分析

2.1 接种固氮菌剂对烤烟农艺性状的影响

由图1可知，参试的2个品种烤烟，T2、T3处理下的农艺性状均显著大于CK（P<0.05）；而T2、T3处理间烤烟的农艺性状的差异均没有达到显著水平（P>0.05）。不同烤烟品种在同一施肥处理下的株高、茎粗、叶长、叶宽均没有显著差异（P>0.05）。

2.2 接种固氮菌剂对烤烟生物量的影响

由图2可知，同一处理下不同品种烤烟的生物量差异均不显著（P>0.05）。2个烤烟品种的根、茎、叶生物量以及总生物量均表现为T2、T3>CK，差异均显著（P<0.05）。T2处理下的根、茎生物量均显著大于T3，而叶生物量和总生物量与T3均没有显著差异（P>0.05），说明减氮配施固氮菌剂不影响烤烟产量（以叶为主）。

2.3 接种固氮菌剂对烤烟叶片养分含量的影响

由表1可知，除全碳、全镁外，不同烤烟品种CK与处理的叶片养分含量均差异显著（P<0.05）。T2、T3处理下全氮、全磷、全钾含量均显著大于CK，全碳含量与CK的差异没有达到显著水平（P>0.05）。T2处理的全氮、全钾含量均显著大于T3，NC102的T2处理全氮、全钾含量比T3分别增加17.20%、24.52%，KRK26的T2处理全氮、全钾含量比T3分别增加11.20%、7.40%。NC102的T2处理全钙、全镁含量与T3处理存在显著差异。KRK26的T2处理全磷含量与T3存在显著差异。

2.4 接种固氮菌剂对烤烟土壤化学性质的影响

由表2可知，不同烤烟品种在不同处理下土壤的pH值均无显著差异（P>0.05）。2种烟叶土壤T2、T3处理下全磷、全钾、 速效磷、 碱解氮含量间没有显著差异，但均显著大于CK；速效钾含量则是CK处理最大。同一处理不同品种烤烟对土壤化学性质的影响有差异，如NC102中土壤有机碳含量显著大于KRK26。

2.5 接种固氮菌剂对烤烟土壤微生物的影响

由图3可知，2种烤烟在不同处理下土壤细菌（图3-a）、放线菌（图3-c）数量均表现为T3处理最大；相反，真菌数量（图3-b）表现为T3处理最小。NC102、KRK26在T3处理下细菌数量比T2分别多44.77%、22.65%；放线菌数量比T2分别多33.81%、31.77%；真菌数量比T2分别少19.28%、15.54%。

2.6 烤烟的生长指标、叶片养分含量、土壤化学性质和土壤微生物之间的主成分分析

图4为烤烟生长指标、叶片养分含量、土壤化学性质和土壤微生物数量间的主成分分析（PCA）结果。第一和第二主成分的累计贡献率达到总方差的74.64%，表明排序结果可信，能够较好地反映不同烤烟品种在不同处理下农艺性状、叶片养分含量、土壤化学性质和微生物特性之间的关系。第一排序轴（解释了45.23%）与株高、茎粗、叶生物量、根生物量、叶长、叶宽、叶片全钾含量、叶片全氮含量、叶片全磷含量和细菌数量、速效磷含量、土壤有机碳含量、土壤全氮含量、土壤全磷含量、全镁含量呈正相关（夹角＜90°，下同），与其他因子呈负相关。第二排序轴（解释了29.41%）与叶片全镁含量、叶片全钙含量呈正相关，与其他因子呈负相关。NC102和KRK26分布在主成分两轴的两侧，不同品种的不同处理均能各自聚为一类，说明不同品种和不同处理对烤烟各指标的影响显著，但各个指标的响应存在显著差异。如土壤有机碳含量、土壤全氮含量、土壤全磷含量、细菌数量均与叶片全钾含量、株高、茎生物量、叶生物量、根生物量、叶长、叶宽、叶片全氮含量、叶片全磷含量显著正相关，与叶片全碳含量、茎粗显著负相关；速效磷含量与叶片全镁、全钙含量显著正相关；叶片全碳含量、茎粗与土壤pH值、全钾含量、碱解氮含量、放线菌数量显著正相关。细菌数量与土壤pH值、速效磷含量呈正相关，放线菌数量与pH值、全氮含量、碱解氮含量正相关，真菌数量与pH值、碱解氮含量、速效钾含量正相关。

3 讨论与结论

固氮菌属于有机营养型细菌，每年固定得到的氮肥达1亿t以上，在解决氮素来源问题上具有巨大的潜力。固氮菌不仅可以提高土壤固氮量，有利于植物根系激素调节，增加植物抗病抗逆能力，促进植物更健康的生长，且固氮菌与化肥配施可以使作物产量增加20％以上［14］。本研究减氮配施固氮菌剂对烤烟的农艺性状（株高、叶长、叶宽等）和叶生物量的影响相较于施全量氮肥处理的差异没有达到显著水平（图1、表2），说明接种固氮菌剂可显著减少氮肥用量且不影响作物的生长和产量，适量固氮菌剂在一定程度上具有氮肥促进植物生长的同等效应，可代替氮肥在农业生产上的使用。与此结果相似，叶文雨等认为，从巨菌草根中分离得到固氮菌能提高大麦（Hordeum vulgare）的叶长、根长、根质量等［27］；宋时丽等的研究也得出类似的结果［8-9］。这也说明微生物菌剂在实现化肥零增长和农业可持续发展等方面具有良好前景。

叶片能明显反映养分的供应情况，在营养诊断中叶片的营养状况是最重要的量化指标［17］。适量的磷、钾营养还能促进脂肪代謝和香气物质的合成。微生物菌剂可提高植物对氮、磷、钾的吸收在许多作物上已有报道［9，16］。与前人的研究结果相似，本研究中减氮配施固氮菌剂处理的烤烟叶片全氮、全磷、全钾含量均显著大于对照，说明减氮配施固氮菌剂有利于增加烤烟对氮、磷、钾素的吸收，改善烟叶的品质，同时可以提高烟叶的抗倒伏性能。此外，本研究还得出全量施氮后烤烟叶片全氮、全磷、全钾含量高于减氮配施固氮菌剂处理。可能是因为氮素参与植物蛋白合成及光合作用等生长代谢及生命活动，全量施氮处理的氮肥使用量较减氮配施固氮菌剂处理多50%，施入充足的氮素更容易被烤烟吸收和利用，因此体内的全氮含量会增多［11］。植物叶片中的养分含量与土壤中养分含量的高低显著相关。刘宇辉等认为，微生物肥和化肥配施有助于增强土壤养分的供贮能力，加强养分循环，并能使得土壤有机质保持平衡［12］。与此结果相对应，本研究得出减氮配施固氮菌后烤烟土壤全磷、全钾、速效磷和碱解氮含量显著高于对照处理（表3），表明接种固氮菌和施入全量氮肥均可以增加烤烟土壤中全磷、全钾、速效磷和碱解氮含量。这与菌剂的生理活性有密切关系，烤烟土中含有许多矿物质成分，在土壤中添加菌剂后，通过菌株的固氮、溶磷、解钾作用，提高土壤中烤烟可利用氮、磷、钾元素［14］。而速效钾含量均是减半施氮肥处理高于减氮配施固氮菌，可能是因为施入的氮肥或菌剂会加速钾细菌对难溶态和固定态钾的分解，且植物吸收的量较大，所以土壤的留存量较少。减氮配施固氮菌后土壤全磷、全钾、速效磷和碱解氮含量与全量施氮肥间没有显著差异（表5）。说明接种的固氮菌对烤烟土壤全磷、全钾、速效磷和碱解氮的贡献效果可能与另一半氮肥相似。不同烤烟品种的全量施氮处理叶片全钙、全镁、全磷、全钾与减氮配施固氮菌处理存在显著差异。可能与巨大芽孢杆菌菌剂中的有益微生物调控植物激素水平、解磷促钾能力，以及提高土壤磷、钾、钙等生物有效性及利用率相关［13，15，28］。

土壤微生物属于土壤生态系统的重要组成部分，它们能够分解土壤中的有机质为作物吸收利用，放线菌还能分泌一些能够抑制某些病原菌生长繁殖的物质，其活性与农作物生长发育的营养供应密切相关［29-30］。在多数情况下，固氮菌能与多种根际微生物共同作用，影响根际微生物的数量和优势菌群的形成，从而促进植物的生长。本研究发现2种烤烟在减量配施固氮菌剂处理下可以显著提高烤烟土壤细菌和放线菌的数量，降低真菌的数量（图3），这与Zhou等的结论［31］相一致。减量配施固氮菌剂处理在施加50%氮肥的情况下添加固氮菌剂，土壤微生物活化土壤养分、氮素转化速率提高［32］，同时减量配施固氮菌剂处理下固氮菌剂的微生物与植物体竞争氮素，使得固氮菌剂的固氮能力增强，微生物活动增强［33］；施加固氮菌剂后可促进植物根系营养元素的吸收利用与分泌物的形成，土壤中氮含量的增加给有益微生物菌群（如细菌和放线菌等）提高了竞争营养的动力［20］，在提高细菌、放线菌数量的同时对真菌产生拮抗作用，减少有害菌群（如真菌）的数量，使土壤向有益微生物菌群、“健康细菌型”方向发展［34］，这同时也与巨大芽孢杆菌调节土壤微生物多样性的能力相关［28］；说明减氮配施固氮菌剂对烤烟根际土壤细菌、放线菌、真菌等微生物组成结构具有一定调节的作用，这与李凤霞等的研究结果［10］一致。贾雨雷等认为，适宜比例肥料配合微生物菌剂的使用可以改善土壤微生物组成结构比例及区系环境，分解土壤养分供植物吸收，提高养分有效性，肥料与微生物菌剂相互影响，在促进作物生长方面形成协同效应［15］。该结果进一步说明固氮菌具有抗病抗逆能力，在固氮的同时能为植物提供更安全的生长环境。另外，接种固氮菌剂对土壤细菌和放线菌的增加效果显著优于施全量氮素。原因之一可能是固氮菌剂的进入可以促进烤烟根际分泌物的增加，从而促进根际细菌和放线菌数量的增加，还可能是因为固氮菌的施入提高了土壤细菌和放线菌生境的养分含量以及增加养分来源，营养的改善有利于其数量的增加。

PCA分析得出土壤pH值、速效磷、速效钾、碱解氮等与细菌、放线菌显著相关，说明接种固氮菌剂后，土壤中有效养分的变化对土壤微生物数量产生了显著的影响，此结果与Lin等的研究结果［33］类似。在本研究的不同处理间土壤pH值虽然没有显著差异，但也可能对某些微生物类群在土壤中的分布产生重要的影响［33］。微生物菌剂会在某种程度上保持和提升土壤pH值［35］。本研究种植烟叶后土壤pH值没有显著变化，给最适生长pH值为6～8非盐碱土的固氮菌提供了非常适宜的生长环境，而土壤酸碱性影响微生物定殖，使得菌剂附着在植物根系的微生物达到较好的生长状态［36］。另外，速磷、碱解氮等速效养分的提升可为细菌、放线菌群落提供充足的养分。适宜的生长环境加上充足的营养物质会加快微生物的繁殖速度，使土壤微生物数量提高。因此，烤烟土壤中三大微生物数量的变化可能也会加速土壤养分循环，增强烤烟的养分吸收，从而促进烤烟生长。

PCA分析还得出烤烟的农艺性状、叶片养分含量、土壤化学性质和土壤微生物间具有显著相关关系（图4），说明固氮菌剂和氮肥处理下对烤烟生长的促进效果是受到多个因素的综合影响。另外，不同烤烟品种之间在接菌处理下对土壤微生物数量（细菌、真菌、放线菌）、农艺性状特别是叶生物量和总生物量的影响没有显著差异，这在一定程度上说明减半施氮配接种固氮菌剂适用于不同的烤烟品种。在今后的研究中可以将减氮配施固氮菌这一措施应用于其他品种的烤烟，以更一步佐证本研究的结论。至于在同一接种处理下不同种烤烟的叶片营养元素含量、土壤化学性质有异，可能与不同品种烤烟需要的营养元素含量不同有关［37］。因此，在使用氮肥与固氮菌剂调节植物生长时，需要考虑土壤碳、氮、磷、钾等元素含量和其他环境限制因素，土壤性质对固氮菌剂附着在植物根际的微生物菌群的活性影响及其与土壤微生物的协同拮抗效应，模型拟合预测氮肥与固氮菌剂的最佳比例及体系效应，筛选高效、复合固氮菌达适地、适植、适菌、适量的良好综合效果，进而推动高效固氮菌应用、作物增产及可持续发展。

综上所述，减半施氮同时接种固氮菌没有影响烤烟的农艺性状、生物量和植物叶片营养积累量，但表现出能够提高土壤中细菌和放线菌数量的作用，在烤烟种植上接种固氮菌剂，主要表现为改善土壤微环境。

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收稿日期：2023-01-09

基金项目：广西重点研发计划（编号：AB18126065）；广西科学院创新团队项目（编号：CQZ-E-1909）；广西自然科学基金（编号：2020GXNSFBA297048）。

作者简介：滕秋梅（1991—），女，广西灵山人，硕士，助理研究员，主要从事喀斯特退化土壤修复和根际生态研究。E-mail：tqm1907@163com。

通信作者：张中峰，博士，研究员，主要从事退化土壤修复研究。E-mail：zfzhang@gxib.cn。