红阳猕猴桃蔗糖转运蛋白基因AcSUT2的克隆及表达分析

鲁明秋　龚小见　刘林娅　龙彩凤　赵超　黄亚成

摘要：蔗糖转运蛋白（SUTs）能够介导蔗糖由源组织到库组织的装载、运输和卸载。以红阳猕猴桃为材料，克隆得到红阳猕猴桃蔗糖转运蛋白基因AcSUT2，并对序列进行生物信息学分析。结果表明，该基因含有1 479 bp的开放阅读框，編码492个氨基酸，分子量和理论等电点分别为53 ku和8.82，包含12个跨膜结构域，属于MFS家族成员和GPH超家族成员。氨基酸序列比对显示，AcSUT2与山茶中蔗糖转运蛋白CsSUT2同源性为84%。进化树分析结果表明，AcSUT2属于蔗糖转运蛋白的SUT4亚家族。组织表达分析显示，AcSUT2在红阳猕猴桃各个组织中均有表达，但在雌花中表达量最高。在果实中，AcSUT2在发育的早中期（花后18～88 d）保持较高的表达量，发育后期表达量下降；CPPU能够显著上调AcSUT2的表达。在叶片中，AcSUT2在叶肉中的表达丰度最高，且随着叶片的发育，在古铜期后表达量逐渐递增。说明蔗糖转运蛋白基因AcSUT2在红阳猕猴桃叶片中蔗糖的装载和果实中蔗糖卸载转运中起着重要作用。

关键词：红阳猕猴桃；蔗糖转运蛋白；AcSUT2基因；基因克隆；表达分析

中图分类号：S663.401文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）21-0036-08

猕猴桃又名奇异果，质地柔软，口感酸甜，含有丰富的维生素C、微量元素、有机物和氨基酸，具有滋补强身等功效，有着“水果之王”的美称，深受广大消费者喜爱，具有极高的经济效益［1-5］。猕猴桃作为贵州省的特色农业产业和乡村振兴战略的重要抓手，种植面积一直在逐年增加。其中，2019年贵州省猕猴桃种植面积为3.5万hm2［6］，而2022年猕猴桃在贵州种植面积超过4万hm2［7］。对于果树而言，获得高产和高品质的果实一直都是果树学科研究的热点和核心问题，因此挖掘果实产量和品质形成的关键基因并进行功能研究对猕猴桃的分子育种具有重要意义。

蔗糖作为光合作用的主要产物，其运输和分配与作物的产量和品质息息相关［8］。蔗糖转运蛋白（sucrose transporters or carriers，SUTs or SUCs）是一种典型的膜结合蛋白，属于MFS（major facilitator superfamily）家族，通常具有12个典型的跨膜结构域，存在于植物的不同组织的细胞中，参与了蔗糖运输、转运和贮藏［9］。自首次从菠菜中发现蔗糖转运蛋白基因SoSUT1以来，现已在众多植物中分离得到蔗糖转运蛋白基因，且大多数植物中蔗糖转运蛋白基因家族包含多个成员［10］。如拟南芥中含有9个［11］、橡胶树中含有6个［12］、水稻中含有5个［13］、胡萝卜和芹菜中含有3个［14-15］。对蔗糖转运蛋白序列进行同源性分析，植物SUT家族共分为SUT1、SUT2、SUT3、SUT4和SUT5这5个亚族［16］。其中SUT1亚族只存在于双子叶植物中，SUT2亚族和SUT4亚族同时存在于双子叶植物和单子叶植物中，SUT3和SUT5亚族仅存在于单子叶植物中，且每一类蔗糖转运蛋白家族成员表现出不同的表达模式和生物学功能［17］。

近年来，随着测序技术的发展，越来越多植物的基因组数据被公布，为植物SUT家族的研究奠定了基础。研究发现，蔗糖转运蛋白不仅仅在光合产物运输和分配中发挥作用，还参与了植物生长发育，产量和品质形成以及应答非生物胁迫等过程。如甘薯蔗糖转运蛋白基因与甘薯块根淀粉积累和糖转运相关，同时IbSUT3可以被非生物胁迫和外源脱落酸诱导表达［18］。水稻蔗糖转运蛋白基因OsSUT4可能在水稻蔗糖源端装载以及籽粒库端卸载等生理过程中发挥重要作用［19］；而OsSUT5则参与了水稻花粉发育与受精过程［20］。苹果中的MdSUT4.1基因调控果实中蔗糖的积累［21］，在苹果中过表达MdSUT2.2提高了抵抗干旱、盐胁迫等非生物胁迫的能力［22-24］。但是，目前关于红阳猕猴桃中蔗糖转运蛋白的研究并不多，它与果实生长发育及品质形成的关系也不清楚。本研究基于红阳猕猴桃基因组数据和转录组数据，克隆了蔗糖转运蛋白AcSUT2基因，对其序列进行生物信息学分析，并分析了其在红阳猕猴桃果实和叶片不同样品中表达模式，研究结果为揭示蔗糖转运蛋白基因AcSUT2在红阳猕猴桃果实和叶片中的功能奠定基础，同时为培育更优秀、更高产的猕猴桃品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试品种为种植在贵州省六盘水市米箩乡的8年生红阳猕猴桃，分别选取植株健康、生长较一致的3株红阳猕猴桃树作为1个生物学重复进行各样品的采集。（1）不同组织材料的采集。雄花、雌花、叶、根、树皮于开花时采集，果实于花后118 d采集，种子于果实后熟软化后采集。果实不同发育时期样品的采集参照果实发育研究结果，分别在花后18、38、58、88、118 d采集。（2）CPPU处理。选择长势一致的红阳猕猴桃在花后21 d用20 mg/L CPPU水溶液浸泡果实3 s，对照用水处理，于花后118 d采集果实。（3）果实不同部位样品的采集。参照张慧琴等的研究结果［25］，对花后118 d的果实分别采集果皮、外果肉、内果肉和果心。不同发育时期叶片样品的采集，分别采集同一枝条上芽期、古铜期、淡绿期和成熟期的叶片。（4）叶片不同部位样品的采集。选取健康的成熟期猕猴桃叶片，分别采集叶柄、主脉、二级脉和叶肉。每个试验均设3个生物学重复，样品采集后立即用锡箔纸包裹并置于液氮中用于RNA的提取。试验时间为2021年12月至2022年5月。试验地点为六盘水师范学院生物科学与技术学院。

1.2 菌株与试剂

RNAprep Pure总RNA提取试剂盒（DP441）、逆转录试剂盒、胶回收试剂盒（DP209）均购自天根生化科技有限公司；TransTaq@ HiFi DNA Polymerase High Fidelity（HiFi）和大肠杆菌（Escherichia coli） DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（P505）和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711）购自诺唯赞-东瑞股份有限公司。DNA测序由生工生物工程（上海）股份有限公司负责完成。其他生化试剂为进口或国产分析纯试剂。

1.3 基因全长cDNA的克隆

以刘林娅等改良的CTAB法［26］提取红阳猕猴桃总RNA，浓度和质量检测符合试验要求用于下一步试验。按照天根生化公司的逆转录试剂盒操作说明书合成cDNA第1链。基于紅阳猕猴桃转录组测序信息，设计AcSUT2基因序列的特异引物（表1），以逆转录的产物为模板，利用巢式PCR法对AcSUT2基因进行cDNA全长扩增。反应体系参照酶使用书，反应程序参照PCR的基本扩增程序。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，按照TIANGEN公司凝胶回收试剂盒说明书进行凝胶回收，回收产物连接到pMD18-T载体送公司测序。

1.4 猕猴桃AcSUT2基因的生物信息学分析

在NCBI网站相关程序中对AcSUT2蛋白序列进行BLAST比较搜索和预测保守结构域，利用其他在线网站和软件预测AcSUT2蛋白的理化性质、亚细胞定位预测、跨膜结构域、蛋白的二级和三级结构以及进行氨基酸同源比对和构建进化树（表2）。

1.5 实时荧光定量PCR分析

采用伯乐公司的CFX96 Touch实时荧光定量PCR仪分析不同处理对AcSUT2基因表达的影响，具体的操作步骤以仪器说明书为准。取1 μg不同处理样品的RNA为试验材料，逆转录合成cDNA第1链后稀释20倍用于实时荧光定量分析。选用SAMSC和18S作为内参基因，基因的荧光定量引物见表1，按照诺唯赞公司ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711）说明书设计反应程序。

1.6 数据处理

所有试验数据均由3次重复试验获得，应用t检验法分析差异显著性，运用最小显著性差数法（LSD）进行单因素方差分析，差异显著性水平均为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 红阳猕猴桃AcSUT2基因的克隆与序列分析

在NCBI数据库中下载其他物种蔗糖转运蛋白序列，通过本地BLAST工具对笔者所在实验室的红阳猕猴桃全长转录组数据库进行比对，获得1条包括完整开放阅读框的基因序列。设计特异性扩增引物（表1），以红阳猕猴桃的cDNA作为模板，克隆得到了该基因（图1），命名为AcSUT2。序列分析显示，该基因cDNA全长1 479 bp，与全长转录组数据库中搜索得到的序列长度相符，且碱基完全一致。将扩增得到的AcSUT2序列与红阳猕猴桃基因组数据库（http：//kiwifruitgenome.org/）进行BLAST，获得该基因的基因组序列。对该基因组序列进行染色体定位分析，结果显示，该基因位于红阳猕猴桃第26号染色体5 257 975～5 263 431 bp处。利用在线软件GSDS2.0对AcSUT2的结构进行分析，结果显示，蔗糖转运蛋白AcSUT2基因包含有5个外显子和4个内含子（图2）。

2.2 红阳猕猴桃蔗糖转运蛋白的生物信息学分析

通过Protparam软件分析AcSUT2蛋白的理化性质，结果显示AcSUT2基因编码的蛋白包含492个氨基酸，其中亮氨酸（leucine，Leu）含量最高，占比达到11.8%。该蛋白质的分子式为 C2 439H3 792N632O650S19，预测其相对分子质量约为 53 ku，理论等电点为8.82，不稳定系数为37.34，脂肪系数为110.22，总的平均亲水性系数为0.550，属于一个较稳定的疏水性蛋白质。通过NCBI的CDD软件预测该蛋白具有蔗糖运转子结构域（17～484位氨基酸）和主要协同转运蛋白家族（MFS）的保守功能结构域（34～456位氨基酸），属于MFS家族成员，也属于蔗糖—H+共转运蛋白（sucrose/H+co-transporters，GPH）超家族成员。利用NetPhos 3.1 Server对AcSUT2的潜在磷酸位点进行预测，发现AcSUT2蛋白具有22个丝氨酸磷酸化位点，13个苏氨酸磷酸化位点和2个酪氨酸磷酸化位点，说明SUT可能具有通过磷酸化修饰进行功能调控。通过SOPMA对AcSUT2蛋白二级结构进行预测，结果表明，该蛋白含有α-螺旋221个，占44.94%；β-折叠82个，占16.67%；β-转角15个，占3.05%；无规则卷曲174个，占35.37%。同时利用SWISS-MODEL软件预测了该蛋白的三级结构，从图3可以看出，AcSUT2蛋白中主要的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲，包含了少量的β-折叠和β-转角，结果与二级结构预测相符。利用在线工具TMHMM对AcSUT2蛋白进行跨膜结构分析，该蛋白具有典型的12个跨膜结构域（分别位于第25～44、57～75、94～114、128～144、171～186、212～229、274～294、322～342、350～370、389～409、427～447和461～479位氨基酸），符合蔗糖转运蛋白具有保守的跨膜结构域的特点。进一步利用CELLO2GO在线工具对该蛋白进行亚细胞定位预测，结果显示AcSUT2蛋白可能主要定位于质膜上。

2.3 AcSUT2蛋白的氨基酸比对及系统进化树分析

利用MEGA 7.0对AcSUT2蛋白和拟南芥（Arabidopsis thaliala）、水稻 （Oryza sativa）、山茶（Camellia sinensis）中的SUTs蛋白编码的氨基酸进行序列多重比对并构建系统进化树（图4）。结果显示，AcSUT2蛋白与CsSUT2、OsSUT2和AtSUC4聚在同一分支上，属于蔗糖转运蛋白的SUT4亚家族，推测AcSUT2蛋白可能具有同亚族蛋白相似的功能。进一步利用DNAMAN软件对与AcSUT2蛋白在同一分支上的蛋白进行同源性比较，结果（图5）显示AcSUT2与CsSUT2的氨基酸序列一致性最高，达到了84%；与OsSUT2和AtSUC4的氨基酸序列一致性分别为66%和57%，表明猕猴桃与山茶的亲缘关系相对较近，同属于山茶亚目。

2.4 AcSUT2基因表达模式分析

2.4.1 AcSUT2基因的组织表达分析 为了分析AcSUT2基因在猕猴桃不同组织中的表达模式，利用qRT-PCR技术检测了其在猕猴桃果实、树皮和雌花等7个组织中的表达量，结果（图6）表明，AcSUT2基因在猕猴桃的7种组织或器官中都有表达，但表达量存在差异；其他组织中的表达量均低于雌花中的表达量，推测AcSUT2基因可能在猕猴桃各个组织器官中发挥了功能 特别是在雌花的生长发育过程中起到重要作用。

2.4.2 AcSUT2基因在果实中的表达 猕猴桃属于呼吸跃变型果实，其果实发育过程包含了细胞分裂期、淀粉积累期和果实成熟期3个阶段［24］。分析猕猴桃不同发育时期果实中AcSUT2基因的表达模式，结果（图7-A）显示，随着果实的发育，AcSUT2的表达量有下降的趋势，但在花后18～88 d的果实中AcSUT2基因的表达量维持在较高的水平，到了花后88 d果实中其表达才有明显的下调，表明AcSUT2基因可能参与了果实的生长发育。利用qRT-PCR技术分析了AcSUT2基因在膨大剂——氯吡苯脲［1-（2-chloropyridin-4-yl）-3-phenylurea，CPPU］處理后果实和未处理果实中的表达变化情况，结果（图7-B）表明CPPU能够显著上调AcSUT2基因的表达。蔗糖通常在果实不同组织间的分配具有不同的特点，为了研究AcSUT2基因是否参与了这一过程，参照张慧琴等的研究［25］将成熟期的果实分为果皮、外果肉、内果肉和果心并分析了基因在这些组织中的表达特性，结果如图7-C所示，AcSUT2基因在果皮和果心的表达量要明显高于外果肉和内果肉。

2.4.3 AcSUT2基因在叶片中的表达 蔗糖要完成“源”组织到“库”组织的转运，需要在叶片中进行蔗糖的装载和运输［27］。利用qRT-PCR分析AcSUT2基因在猕猴桃不同发育时期叶片和稳定期叶片不同部位中的表达特性，结果（图8-A）表明，AcSUT2基因在芽期叶片中的表达量较高，而进入古铜期后，其表达量下调幅度达到2倍；之后随着叶片的发育，基因呈显著上调表达，稳定期恢复到芽期的水平。而稳定期叶片不同部位中AcSUT2基因的表达呈现明显的差异性，其中AcSUT2基因在叶肉细胞中的表达丰度最高，是叶柄中表达量的3倍；在二级脉和主脉中的表达量也是叶柄中表达量的2倍（图8-B）。

3 讨论与结论

蔗糖作为光合作用的主要产物，其运输和分配直接影响了作物的产量和品质［8］。而蔗糖转运的载体-蔗糖转运蛋白，在源组织韧皮部蔗糖的装载、运输韧皮部蔗糖的回收和运输，以及库组织韧皮部蔗糖的卸载过程中起着重要的作用［28］。分离鉴定红阳猕猴桃中的蔗糖转运蛋白，了解其表达模式，有助于解析猕猴桃蔗糖的装载、运输和分配机制，为获得更优秀猕猴挑品种提供理论依据。

本研究克隆得到的红阳猕猴桃蔗糖转运蛋白AcSUT2基因，编码了492个氨基酸，具有12个跨膜结构域，包含蔗糖运转子和MFS的保守功能结构域，亚细胞定位预测在质膜上。系统发育分析该蛋白属于蔗糖转运蛋白SUT4亚族，且序列比对也显示AcSUT2氨基酸序列与其他物种中SUT4亚族的蔗糖转运蛋白的氨基酸序列具有较高的相似性。Kühn等将植物中的蔗糖转运蛋白分为5个亚族，各亚族成员氨基酸序列的差异暗示它们在植物体内具有不同的生物学功能［16］。根据序列与功能的高度保守，AcSUT2可能与AtSUT4一样，属于低亲和性/高转运能力类型的蔗糖转运蛋白，能介导高浓度蔗糖在细胞内外的运输，参与蔗糖的装载等过程［29］。后续将在酵母突变体（SUSY7/ura3）菌株中对AcSUT2蛋白进行蔗糖转运活性的研究提供基础。

目前为止，在梨［30］、苹果［31］和桃［32］等作物中均已克隆得到蔗糖转运蛋白基因，并明确了它们可以通过参与源器官和库器官中蔗糖装载、运输、卸载和贮藏进而调控果实的生长发育和品质形成。红阳是我国自主培育的优秀猕猴桃品种，具有红色的内果肉和高糖低酸的优良特点［33］，在四川和贵州省六盘水广泛种植，成为国家乡村振兴的重要产业。而当前对于蔗糖转运蛋白是否通过调控猕猴桃源组织（叶）和库组织（果实）中蔗糖的代谢影响其优良性状的形成尚未清楚。本研究中猕猴桃SUT4亚族成员AcSUT2的组织表达分析显示其在所检测的7个红阳猕猴桃的组织和器官中均有表达，这表明AcSUT2可能参与了源器官和库器官中蔗糖代谢，具有蔗糖转运蛋白SUT4亚族成员表达模式和功能多元化的特点［34］。猕猴桃果实作为主要的库器官，果实发育的早期是细胞分裂、分化的高峰期，也是淀粉大量积累的阶段，因此需要充足的蔗糖输入果实［35］。2016年陈成的研究证实，在猕猴桃果实的发育阶段，蔗糖是以质外体途径通过韧皮部卸载到果实中的［36］。在本研究中，AcSUT2基因在果实发育的早期表达量处于较高的水平，而在果实发育后期表达开始下降，且CPPU能够显著上调AcSUT2的表达。结果表明，AcSUT2可能在猕猴桃果实的膨大初期和快速膨大期通过介导蔗糖的卸载影响果实中蔗糖的输入，从而调控果实的生长发育。同时，成熟期果实不同部位的表达模式显示，AcSUT2基因主要在果心和果皮中大量表达，这很可能在于AcSUT2参与了蔗糖在果实不同组织部位的分配。叶片作为输入果实中蔗糖的主要合成场所，其合成蔗糖能不能有效地装载、输出会严重影响果实的生长发育［37］。对叶片不同发育时期中AcSUT2基因的表达分析结果显示，叶片从古铜期发育到成熟期，AcSUT2呈明显的上调表达。事实上，随着叶片的发育，叶片光合作用合成蔗糖的能力也会增强，因此高表达水平的蔗糖转运蛋白AcSUT2可以帮助叶片中蔗糖更好地代谢。而芽期叶片中AcSUT2基因的表达量较高则主要是因为芽期的叶片属于库器官，需要大量的蔗糖来满足自身的生长发育。成熟期叶片不同部位中AcSUT2基因表达模式的分析结果显示，AcSUT2主要在叶肉组织中高度表达，表明AcSUT2基因可能是参与叶片中蔗糖装载的候选蔗糖转运蛋白基因，但是此结论还需要进一步验证。

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收稿日期：2023-02-25

基金项目：贵州省科学技术基金（编号：黔科合基础［2020］1Y115、黔科合基础［2019］1445號）；贵州省六盘水市科技计划（编号：52020-2022-PT-03、52020-2022-PT-20）；六盘水师范学院高层次人才科研启动基金（编号：LPSSYKYJJ201705、LPSSYKYJJ202205）；六盘水师范学院科学研究计划（编号：LPSSYLPY202213）。

作者简介：鲁明秋（1995—），男，内蒙古巴彦淖尔人，硕士研究生，研究方向植物生物化学与分子生物学。E-mail：871463532@qq.com。

通信作者：黄亚成，博士，副教授，研究方向为植物生物化学与分子生物学，E-mail：yachenghuang1314@126.com；赵 超，硕士，正高级实验师，研究方向为中药化学成分与药物代谢，E-mail：chaozhao@126.com。