辣椒生长素抑制蛋白基因CaARP1的克隆及其对青枯菌侵染的响应

刘艳艳　丁颖　刘兴华　郑佳秋

摘要：生长素响应基因编码生长素抑制蛋白（ARP），是非常重要的下调基因，能够抑制生长素（IAA）信号的转导，在植物的生长、发育、抗病、抗逆以及种子休眠等过程中发挥重要作用。为解析辣椒ARP1基因的序列特征和功能，以辣椒品种CM334为试材，克隆获得辣椒ARP1基因cDNA全长序列，命名为CaARP1，GenBank登录号为AAR83888.1。序列分析结果表明，辣椒CaARP1基因的cDNA全长228 bp，没有非翻译区，包含1个228 bp的开放阅读框架，编码75个氨基酸。CaARP1基因含有2个外显子和1个内含子，全长385 bp。CaARP1蛋白的分子量为8.298 ku，理论等电点为9.99，没有跨膜结构，不存在信号肽，为亲水性不稳定蛋白，二元结构元件多为无规则卷曲。CaARP1蛋白与同属茄科植物的马铃薯、番茄、黄果茄、烟草生长素抑制蛋白的同源性较高，序列一致性分别为95.00%、96.67%、93.24%、91.89%。实时荧光定量PCR分析结果表明，CaARP1基因在青枯菌侵染1～7 d期间均呈现极显著下调的趋势，推测该基因可能在辣椒应答青枯病侵染中发挥重要作用。

关键词：辣椒；CaARP1基因；基因克隆；序列分析；表达分析

中图分类号：S641.301；S436.418.1+9 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）21-0013-06

植物可以通过多种抗病途径抵御环境中众多病原菌的侵染，但抗病性的建立会以减慢植物生长为代价，如植物受到病菌侵染时，则减弱生长信号通路，激活防卫反应上游的基因或转录因子来抵御病原物侵染；在无病菌侵害时，使抗病信号通路处于非激活状态来关闭抗病途径，植物生长不受抑制［1-2］。生长素作为调节植物生长的信号分子，通过与受体组织器官结合来激活生长素响应因子，以实现促进或抑制生长素相关基因的转录，从而参与植物生长发育的过程和对疾病等的防御过程［3-4］。生长素应答基因主要包括受生长素信号激活表达的生长素激活基因和受生长素信号抑制的生长素抑制基因［5-8］，其中生长素抑制基因主要包括生长素抑制蛋白（auxin repressed protein，ARP）基因和休眠相关蛋白（dormancy related protein，DRM）基因［5］，二者密切相关，一起形成ARP/DRM基因家族。

人们对生长素的研究主要集中在受生长素信号诱导上调表达的基因上［9-11］，如ARF、SAUR等，然而关于受生长素诱导下调表达的基因却研究较少［12-14］，如生长素抑制蛋白基因，该基因是在抑制生长素信号转导过程中起重要作用的下调基因，能够参与下游基因的表达调控。生长素抑制蛋白除了可以调节植物生长和调控植物激素生长素变化［13，15-16］，也在植物应答病原菌中发挥重要的作用。研究发现，在拟南芥中miR393基因被诱导后，生长素受体蛋白TIR1被下调，生长素信号的传递受到抑制，生长素合成发生改变，低量的生长素提高了生长素抑制基因的表达［17］。苏盼盼在感病和抗病水稻品种中接种稻瘟病病菌，发现抗病品种中OsARP1和其他3个生长素抑制蛋白同源基因对稻瘟病病菌的响应较感病品种中的更为敏感，与感病品种相比，抗病品种中 OsARP1被诱导表达的速度更快，效率更高［18］。但是，在已有的研究中極少见到辣椒ARP1对青枯菌产生生理响应及抗性机制的报道。

辣椒（Capsicum annuum L.）是一种栽培范围广、经济效益高且深受人们喜爱的茄科蔬菜，在农业生产中具有重要的地位［19］。而在大田生产过程中，夏季高温高湿的气候和种类繁多的土传病害病原菌共存的环境成为了辣椒长期演化过程中的选择压力。在这种选择压力下，辣椒很可能会进化出一套精细复杂的抗青枯病和耐高温高湿胁迫的机制［20］。然而，目前对辣椒抗青枯病的机制研究的报道依然较少，因此挖掘抗青枯病相关基因和研究抗青枯病机制对培育抗青枯病辣椒品种具有重要意义。笔者所在团队前期利用RNA-seqs技术分析了辣椒在青枯菌侵染过程中的转录组数据，发现生长抑制蛋白CaARP1的转录水平出现了持续下调的趋势。因此，本研究通过克隆获得辣椒APR1基因cDNA全长序列，并对该基因进行相关生物信息学分析，并使用实时荧光定量PCR技术确认了CaARP1在青枯菌侵染下下调表达的特征，为进一步解析CaARP1在辣椒青枯侵染过程中的作用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料和处理

本研究以辣椒品种CM334为试验材料，由福建农林大学遗传改良中心提供。试验时间为2021年6月至2023年5月，试验地点为福建农林大学遗传改良中心。青枯菌处理：本试验使用灌根法［21］接种辣椒植株，准备青枯菌菌体，悬浮于经高压灭菌的双蒸水中，D595 nm调至0.8（浓度为1.0×108 CFU/mL），并倒入育苗瓶进行接种处理，接种辣椒苗置于28 ℃人工气候箱培养，分别在接种后1、3、5、7 d收集辣椒茎基部往上2 cm茎段用于RNA提取。

1.2 辣椒总RNA提取及cDNA的合成

使用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒提取辣椒幼苗叶片总RNA。使用反转录试剂盒PrimeScript TM RT-PCR Kit 进行反转录合成 cDNA，作为基因克隆的模板。

1.3 辣椒CaARP1基因的克隆

以辣椒全基因组数据库（http：//peppersequence.genomics.cn）为参考，对辣椒转录组测序数据进行分析，根据UniGene注释结果CaARP1基因全长序列，并设计基因特异性引物进行PCR扩增，ARP-F：5′-gctaagagagaagATGGTGTTGATTGATAAACTTTGGG-3′；ARP-sma I-R：5′-gcccttgctcaccatcccgggTGATGCTTAGATCTGGTGTTCCC-3′，以辣椒叶片cDNA为模板进行PCR扩增。扩增产物用柱式胶回收试剂盒回收，委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，得到辣椒CaARP1基因的cDNA序列。

1.4 CaARP1基因的生物信息学分析

利用ORF finder软件在线分析CaARP1的开放阅读框架，并预测其编码蛋白的氨基酸序列。利用ExPASy ProtParam分析辣椒CaARP1蛋白的理化性质；利用NCBI上的CDD分析辣椒CaARP1蛋白的保守结构域；利用SOPMA和SWISS-MODEL分别预测辣椒CaARP1蛋白的二级结构和三级结构；利用ProtScale预测辣椒CaARP1蛋白的亲疏水性；利用TMHMM 2.0和SignalP 5.0分别预测辣椒CaARP1蛋白的跨膜结构域和信号肽；利用PSORT预测辣椒CaARP1蛋白的亚细胞定位。利用ClustalX 2.0软件比对辣椒CaARP1及NCBI上下载的其他物种同源ARP的氨基酸序列，并用MEGA 5.05软件构建系统进化树（bootstrap=1 000）。各生物学信息分析软件网址详见表1。

1.5 CaARP1基因的实时荧光定量PCR表达分析

利用实时荧光定量PCR检测青枯菌灌根处理后0、1、3、5、7 d辣椒CaARP1基因的表达量。根据CaARP1基因的序列设计定量PCR引物，CaARP1-Fq：CAAACTCCGAAAGAGCCTCTCT和CaARP1-Rq：TCATGATGCTTAGATCTGGTGT；内参基因CaActin的引物为CaActin-F：TTGGATTCTGGTGATGGTGTG和CaActin-R：AACATGGTTGAGCCACCACTG。PCR反应体系及反应条件参考文献［21］。每个样品重复3次，使用2-△△CT法分析结果［22］。数据采用SPSS 19.0 软件分析，结果保存成“平均值±标准差”的形式，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 辣椒CaARP1基因全长cDNA序列的获得

辣椒CaARP1基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，在230 bp左右有单一条带，测序后获得辣椒ARP1基因全长cDNA序列，命名为CaARP1，GenBank登录号为AAR83888.1。该基因cDNA片段全长228 bp，没有非翻译区，包含1个228 bp的开放阅读框架，编码75个氨基酸（图2）。

2.2 辣椒CaARP1基因的生物信息学分析

2.2.1 基因结构 将辣椒CaARP1基因的cDNA序列与DNA序列进行比对（图3）后发现，在基因组水平上，CaARP1基因含有2个外显子、1个内含子，全长385 bp。

2.2.2 理化性质 在NCBI上进行保守结构域分析，发现将CaARP1蛋白含有1个Auxin_repressed结构域，位于第20～72个氨基酸位置，是一种生长素抑制蛋白。CaARP1蛋白的理化性质：预测其分子式为C366H563N109O111S1，原子总数为1 150，相对分子质量为8.298[KG*3]ku，含有75个氨基酸。CaARP1蛋白的理论等电点为9.99，含有带负电荷残基（Asp+Glu）5个，带正电荷残基（Arg+Lys）9个，脂肪系数为44.13，蛋白质三维结构不稳定指系数为44.95，是一种碱性不稳定蛋白。

2.2.3 二级结构和三级结构 辣椒CaARP1蛋白的二级结构预测结果显示该蛋白由3种二级结构元件组成，包括占比6.67%的α-螺旋、22.67%的延伸链和70.67%的无规则卷曲（图4-A）。利用SWISS-MODEL软件构建辣椒CaARP1蛋白可能的三级结构模型，结果见图4-B，空间结构以无规则卷曲为主，含有部分α-螺旋和延伸链，同二级结构预测结果基本上一致。

2.2.4 疏水性 根据ProtScale软件预测CaARP1蛋白亲疏水性，结果显示该蛋白在第34个氨基酸处出现最大值，为0.344，疏水性最强； 在第70个氨基酸处出现最小值，为[KG*5]-3.022，亲水性最强（图5）。

该蛋白亲水性平均值为-0.924，推测其为一种亲水性蛋白。

2.2.5 信号肽和跨膜结构域 通过SiganalP 5.0软件分析辣椒CaARP1蛋白信号肽序列，结果表明，该蛋白未发现信号肽及其剪切位点，说明该蛋白属于非分泌蛋白。通过在线生物软件TMHMM 2.0预测辣椒CaARP1蛋白的跨膜结构域，结果表明该蛋白没有明显的跨膜结构，是一种非跨膜蛋白质。

2.2.6 亚细胞定位 利用PSORT对辣椒CaARP1蛋白亚细胞定位进行预测，结果表明CaARP1蛋白最可能被定位于細胞核（60.9%），其次是线粒体（26.1%），再次是分泌系统囊泡（4.3%）、过氧化物酶体（4.3%）、细胞质（4.3%）等。

2.2.7 同源性与系统进化关系 NCBI在线通过Blastp将CaARP1基因推导的氨基酸序列与GenBank中已经登录的黄果茄AAS75891.1（Solanum virginianum）、烟草AAS76635.1（Nicotiana tabacum）、欧白英XP_055805508.1（S. dulcamara）、马铃薯XP_006347006.1（S. tuberosum）、彭氏番茄XP_015068255.1（S. pennellii）、喜马拉雅凤仙花XP_047328583.1（Impatiens glandulifera）、胡桃XP_018858854.1（Juglans regia）、欧洲油菜XP_013734249.1（Brassica napus）、萝卜KAJ4891583.1（Raphanus sativus）、牡丹ABW74471.1（Paeonia suffruticosa） 、阿月浑子XP_031278964.1 （Pistacia vera） 、番茄NP_001307367.1（S. lycopersicum）、牛奶子AAC62104.2（Elaeagnus umbellata）、牵牛XP_019175658.1（Ipomoea nil）等植物的ARP氨基酸序列进行同源性比对，发现辣椒CaARP1氨基酸序列与这些物种的ARP氨基酸序列的一致性分别为93.24%、91.89%、90.54%、95.00%、81.82%、80.00%、71.83%、69.01%、71.43%、65.00%、83.02%、96.67%、71.83%、88.00%，相似性较高，均达到60%以上，N端和C端的氨基酸序列高度保守（图6）。

由图7可知，同属茄科植物的马铃薯、番茄、黄果茄、烟草的ARP蛋白处于同一分支，具有较高的同源性，其中马铃薯和番茄的ARP蛋白与辣椒CaARP1的同源性最高，亲缘关系最近。辣椒CaARP1与十字花科欧洲油菜和萝卜ARP蛋白的亲缘关系较远。

2.3 CaARP1基因在青枯菌处理下的表达分析

参与植物防御反应的基因在病原菌侵染过程中往往表现出诱导表达或抑制表达的趋势。为了推测CaARP1基因在辣椒应答青枯菌侵染中的可能功能，本研究分析了其在青枯菌侵染过程中的转录水平变化情况。本研究使用灌根的方法在辣椒根部接种青枯菌，在接种后1、3、5、7 d收集茎基部（青枯菌大量繁殖的主要组织）提取总RNA。通过荧光定量PCR检测了CaARP1的表达水平，由图8可知，接种1 d后 CaARP1转录水平出现了极显著下调的趋势，该趋势持续到了接种后7 d。以上结果暗示着CaARP1在辣椒应答青枯菌侵染过程中发挥着重要的作用。

3 讨论与结论

对于生长素信号的识别、合成及代谢相关蛋白基因表达调控，需要很多基因的参与。在烟草中通过对生长素抑制基因NtARP1沉默和过表达发现，NtARP1基因是调节烟草生长和抗病的重要因子［23］。Park等的研究表明，黑刺槐生长素抑制蛋白RpARP编码基因表达与植株生长呈负相关，当生长素含量高时，其表达量就降低，植株表现为生长［24］，Zhao等的研究表明，烟草生长素抑制蛋白NtARP1可激活细菌蛋白激发子诱导的过敏反应［23］。

辣椒是茄科植物的典型代表。笔者所在实验室前期工作中，利用RNA-seqs技术分析了辣椒在青枯菌侵染过程中的转录组数据，发现生长抑制蛋白CaARP1的转录水平出现了持续下调的趋势，本研究使用荧光定量PCR技术确认了CaARP1在青枯菌侵染下下调表达的特征。大量研究表明，植物在遭受到病原菌侵染的过程中，可暂时性地通过关闭生长发育相关基因的表达而抑制植物的生长发育，而通过驱动免疫相关基因的表达激活植物防御反应，对病原菌的入侵作出积极响应，该策略可以帮助植物在有效的资源情况下，合理调控基因的表達，保证植物生长和防御之间的平衡［25-28］。CaARP1编码蛋白在青枯菌侵染下出现了持续下调的趋势，笔者推测在青枯菌侵染辣椒过程中，病原菌通过直接或者间接的方式抑制生长抑制蛋白CaARP1的转录水平，解除CaARP1对辣椒生长的抑制作用，促进了辣椒的生长并通过某些机制关闭寄主的防御反应，实现其侵染的目的，具体的分子机制有待于进一步解析。

本研究以辣椒品种CM334为研究材料，成功克隆了辣椒CaARP1基因cDNA全长序列，长度为 228 bp，包含一个228 bp的开放阅读框架，编码75个氨基酸。CaARP1蛋白为碱性亲水性非分泌蛋白，与番茄同源性最高、亲缘关系最近。CaARP1蛋白分子量为8.298 ku，理论等电点为9.99，带正电荷和负电荷的氨基酸数分别为9、5个。该蛋白最可能位于细胞核，无规则卷曲在预测的二级结构中占比最大。CaARP1基因在青枯菌处理后的表达量呈现了持续下调的趋势，暗示该基因很可能在辣椒应答青枯病过程中发挥重要作用。后期的研究可以通过转基因和病毒诱导基因沉默研究CaARP1蛋白在辣椒应答青枯菌中的功能。

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收稿日期：2023-08-18

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金［编号：CX（21）3031］；江苏省农业重大新品种创制专项（编号：PZCZ201715）。

作者简介：刘艳艳（1990—），女，山东日照人，硕士，助理研究员，主要从事作物抗逆育种研究。E-mail：1052233980@qq.com。

通信作者：郑佳秋，硕士，副研究员，主要从事辣椒抗逆育种研究。E-mail：nky8236@163.com。