线粒体相关基因多态性与血脂和非酒精性脂肪性肝病的相关性研究

宋 佳,连丽丽

(吉林大学第一医院 检验科,吉林 长春130021)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是在没有酒精滥用史或继发性肝脂肪变性等其他原因的情况下,肝脏脂肪过度沉积[1]。研究显示,NAFLD的发展和向更高级阶段的进展与遗传因素有关[2-3],识别可能导致严重NAFLD的风险基因,具有重要意义。NAFLD遗传决定因素中有一些与线粒体相关的单核苷酸多态性(SNP),如维持氧化还原稳态的超氧化物歧化酶(SOD),包括SOD2和SOD3,它们的功能障碍会加重与NAFLD发病机制密切相关的氧化应激反应[4]。另外,有文献报道,来自两个基因SOD2、SOD3的两个多态性SOD2rs4880、SOD3rs25

36512与NAFLD危险因素如2型糖尿病有相关性[5-7]。而高甘油三酯血症为胰岛素抵抗(IR)状态下最常见的脂质异常,是由于富含TG的脂蛋白(VLDL)的产生增加,并且与小而密低密度脂蛋白颗粒和低HDL-C水平的出现有关,后者在NAFLD进展中起作用[8]。说明这两个基因多态性可能与IR状态下的血脂异常,尤其是高甘油三酯血症和低HDL-C水平有关;还提示IR状态下的血脂异常可能会增加NAFLD的严重程度。而与NAFLD发展相关的危险因素胰岛素抵抗也可用高TG/HDL-C比率作为其替代指标[9]。本研究旨在探讨SOD2和SOD3基因多态性与高TG、低HDL-C、高TG/HDL-C和NAFLD严重程度的关系,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2020年1月至 2022年3月吉林大学第一医院肝胆胰内科有疑似NAFLD的体征或症状和/或有NAFLD危险因素(吸烟、血脂异常、糖尿病、高血压和肥胖)的患者396名。除外自身免疫性肝病、药物、全胃肠外营养等可致脂肪肝的情况,并排除过量酒精摄入,指饮酒折合乙醇量,男性每周小于140 g,女性每周小于70 g。将他们标记为NAFLD高危受试者,其中389名受试者经CT证实为NAFLD,并对其严重程度进行分级[10-11]。根据CT 检测:肝/脾 CT 比值<1.0但>0.7者为轻度,≤0.7但>0.5者为中度,≤0.5者为重度 NAFLD。为评估NAFLD的严重程度,进一步将受试者分为两组,分别为无至轻度和中至重度NAFLD组。其中无至轻度组患者268例,中至重度组患者121例。

体重指数≥25 kg/m2判定为肥胖。所有异常的脂质和脂蛋白谱均遵循国家胆固醇教育计划和成人治疗小组Ⅲ(NCEP-ATP Ⅲ) 指南。HDL-C值低于第 50 个百分位数(HDL-C<1.0 mmol/L)考虑低HDL-C水平,空腹血清TG水平≥1.7 mmol/L考虑高TG水平。受试者的一种或多种血脂水平异常,或目前正在服用降脂药物,或有血脂异常病史,被定义为血脂异常(DL)。本研究中“高 TG/HDL 比值”的分界点为 3.7,这是通过用于预测NAFLD严重程度的 ROC 曲线确定的。

1.2 实验室检查

禁食12 h后采血,使用贝克曼AU5841全自动生化分析仪测定血脂参数和空腹血糖(FBS),用索灵LIAISON XL2210全自动化学发光免疫分析仪测定空腹胰岛素水平。胰岛素抵抗的稳态模型评估(HOMA-IR)按[FBS(mmol/L)×空腹胰岛素水平(μU/mL)]/22.5计算。

1.3 DNA提取和基因分型

根据试剂说明书,使用QIAamp DNA微型试剂盒(Qiagen)从200 μl 全血样本中提取基因组DNA。将提取的DNA溶解至30 ng/μl,并储存在-80℃以下。为了对这两个SNP进行基因分型,使用LightCycler 480系统(Roche Applied Science,German)进行了实时聚合酶链反应(PCR)和高分辨率熔解(HRM) 分析。扩增以10 μl体积进行。野生型和突变型纯合子通过在PCR前加入具有已知基因型序列的样本来区分。未知基因组DNA 30 ng与已知野生型DNA3.0 ng(之前已通过测序确认)一起用作模板。使用LightCycler 480 基因扫描软件分析结果。随机选择的50个样本在ABI7000序列检测系统(Applied Biosystems,USA)上通过直接测序进行验证。使用HRM或直接测序获得的基因型结果彼此一致。

1.4 统计学分析

采用SPSS 18.0进行统计学分析,卡方检验分析对照组的Hardy-Weinberg平衡(HWE)以及病例组和对照组之间的基因分布差异。非条件Logistic回归模型计算优势比(OR)及其95%可信区间(CI),评估基因多态性与NAFLD严重程度的关系。Kolmogorov-Smirnov 正态性检验对连续变量进行正态分布检验。具有偏态分布的变量在后续数据分析之前进行 log10-转换。t检验用于比较两组之间连续变量的均值。方差分析(ANOVA) 用于比较3个或更多组之间的变量,之后进行事后检验(Scheffe 程序)。所有连续变量均表示为平均值±标准偏差(SD)。所有P值均为双侧,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究人群的一般情况

为了进一步分析,首先根据NAFLD程度将研究人群分为两组,表1显示了两组研究对象的一般情况。高TG/HDL-C 比率的受试者频率在中至重度组(59.5%)中显著高于无至轻度组(46.3%,P<0.05),表明中至重度组更容易出现高TG/HDL-C 比率。与无至轻度组的患者相比,中至重度组的平均年龄和腰臀比显著增加,TC、TG、LDL-C和TG/HDL-C水平升高,而HDL-C水平降低(P均<0.05)。

表1 无至轻度NAFLD组和中至重度NAFLD组临床资料比较

2.2 SOD2和SOD3基因多态性与TG和HDL-C的关系

在研究人群中,SOD2 rs4880位点检测到TT、TC和CC3种基因型;SOD3 rs2536512位点检测到GG、GA和AA 3种基因型。两基因多态性位点的各种基因型分布均遵循HWE(P>0.05)。表2总结了每个个体多态性中基因型与TG、HDL-C和TG/HDL-C之间的关系。对于SOD3 rs2536512,与GG型相比,AA型具有更高的 TG水平和TG/HDL-C 比值(P<0.05)。

表2 不同基因型的TG和HDL-C水平

表3为Logistic回归分析结果,对于SOD2 rs4880,与TT型相比,CC型出现高TG(≥1.7 mmol/L) [调整后OR=3.23,95%CI(1.20～8.75),P=0.021)],高 TG/HDL-C 比率(≥3.7) [调整后OR=2.57,95% CI(1.06-6.24),P0.037]和高TG 合并低 HDL-C(<1 mmol/L) [调整后OR=3.60,95% CI(1.06-12.19),P=0.040]的风险显著增加。对于SOD3 rs2536512,与GG型相比,AA型出现高TG [调整OR=2.09,95%CI(1.08-4.05),P=0.029)]和高TG合并低HDL-C(<1 mmoL/L)的风险显著增加[调整后OR=2.87,95%CI(1.27～6.5),P=0.011]。

表3 SOD2和SOD3基因多态性与TG和HDL-C的关系

2.3 NAFLD严重程度相关的危险因素分析

为了评估血脂水平异常是否可以预测NAFLD的严重程度,以NAFLD严重程度作为血脂异常的函数并和其他相关危险因素进行了关联分析。结果只有高TG/HDL-C比率(≥3.7)与NAFLD的严重程度(中至重度风险组)相关,调整后的OR=2.26,95%CI(1.17-4.34)(见表4)。

表4 与NAFLD严重程度相关的危险因素分析

2.4 SOD2和SOD3基因多态性与NAFLD严重程度的关系

进一步研究SOD2 rs4880、SOD3 rs2536512位点携带的基因型是否与NAFLD的严重程度相关。所有基因变异均与NAFLD的严重程度没有关联(见表5)。

表5 SOD2和SOD3基因多态性与NAFLD严重程度的相关性

3 讨论

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代谢综合征的一种常见肝脏表现,在一般人群中的患病率为20%～30%,其发病率随着肥胖发病率的增加而上升[12-13]。这种疾病包括一系列临床病症,从简单的脂肪堆积到非酒精性脂肪性肝炎(NASH),再到导致肝硬化、肝细胞癌(HCC)和死亡的晚期纤维化[14]。NAFLD的发病机制是多因素的[15],久坐不动、肥胖和相关合并症,如糖尿病、血脂异常、胰岛素抵抗等都是与NAFLD发展相关的重要危险因素[16-17]。但并非所有具有相似社会人口学和身体特征的受试者都会发展为 NAFLD,也并非所有患NAFLD的受试者都会发展为更晚期的疾病,这表明NAFLD的发病机制和进展存在明显的个体差异[18-19]。

本研究探讨了两种线粒体相关基因变异与血脂水平、NAFLD严重程度的关联。尽管两种线粒体相关基因变异的组合与NAFLD的严重程度没有直接关系;但它们与高TG、低HDL-C水平显著相关,本研究首次报道了这些线粒体相关基因中的两种遗传变异与NAFLD高风险受试者血脂异常之间的联系。SOD2c.4C>T(rs4880)的CC型和SOD3c.1G>A(rs2536512)的AA型更容易发生高甘油三酯血症和低HDL-C。而本研究发现中至重度NAFLD组的高TG/HDL-C比值(≥3.7)与NAFLD的严重程度独立相关。这一发现提示SOD2 c.4C>T(rs4880)CC型和SOD3c.1G>A(rs2536512)AA型的NAFLD高风险人群应关注其TG、HDL-C和两者比值的变化,防止NAFLD病情进一步发展。总之,本研究中观察到的SOD2和SOD3多态性与NAFLD血脂异常的关联,可能是由于基因多态性、其修饰的蛋白质功能、其涉及的抗氧化途径以及研究人群的潜在条件的相互作用。然而,需要进一步研究证实这一假设。

本研究有一定的局限性,首先,由于新鲜血液的数量不足,缺乏功能研究来调查不同基因型对抗氧化基因的表达以及氧化应激指标的影响。其次,这项研究仅在中国东北地区汉族人群受试者中进行,缺乏其他种族人群的研究,没有将种族特异性遗传变异和不同环境因素带来的影响考虑在内。此外,相对有限的样本量可能会影响检测关联的统计能力。因此,这些发现应该被认为是探索性的,直到它们可以在更大的样本量中被复制。

线粒体相关基因中的两种多态性(SOD2 rs4880和SOD3 rs2536512)与NAFLD的严重程度无直接关系,但高TG/HDL-C比率与NAFLD的严重程度相关,高TG/HDL-C 比率是NAFLD病情进展的危险因素。对于NAFLD的高风险人群,SOD2 rs4880位点携带CC基因型和SOD3 rs2536512位点携带AA基因型的个体更容易发生TG水平和HDL-C异常,携带危险基因型的这类人群应重点关注其TG、HDL-C水平和两者比值变化情况,防止NAFLD进展,病情恶化。