兰花草水提取物急性毒性试验及药效作用研究*

钟承志,吴德松,张梦麒,龚吕东,李 婷,颜 宏,郭 琰△

(1.云南省药物研究所,云南 昆明 650111;2.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室,云南 昆明 650111)

兰花草最早记载于《滇南本草》[1]中,《滇南本草》系云南明代医学家兰茂历经20年所著的一部记载和研究滇南地区特色药材和民族民间用药经验的一部地方性本草学专著。兰花草为兰科(Orchidaceae)植物长叶兰Cymbidium Lo Cymbidium Longifolium;hemostasis;diuretic;digestion promotion;acute toxicity ngifolium D.Don。多年生常绿草本,药用部位:全草。

书中记载:“兰花草,味苦、辛,治五淋便浊,利小便,除湿热”,附方“治妇人赤带、或红白相间,或下阴作痒,小便急胀”和“昔一人常患鼻血之症,每月数次,服此草,断其根,其效甚远[2]”;其中记载药方“兰花草三钱,红牛膝二钱,地肤子一钱(水煎),点水服酒[3]”。查阅文献,极少发现有关兰花草药效及毒性方面的研究报道,结合古书记载,笔者对兰花草的急性毒性、利尿[5]和止血作用等相关药效进行研究,考证古书所记载的疗效,也为该中药的研发提供一定的实验依据。

1 实验材料

1.1 受试样品及实验动物 SPF级KM小鼠,体重18～22 g,由辽宁长生生物技术有限公司提供。生产许可证号:SCXK(辽)2015-0001;兰花草水提物,由云南省药物研究所天然药物化学研究室提供,批号:20161221;氢氯噻嗪片,常州制药厂有限公司生产,批号:16062012;大黄,江阴天江药业有限公司生产,批号:1510124;酚磺乙胺注射液,国药集团荣生制药有限公司,批号:1508323。

1.2 提取物制备 兰花草粗碎,加水回流提取2次,加水量分别为10倍和8倍,提取时间分别为2 h和1 h,过滤,滤液合并,浓缩干燥得提取物浸膏,提取率为:15.62%。

1.3 样品溶液及阳性对照药配制 根据前期药效预实验的研究结果,本文中药效实验兰花草水提物小鼠给药剂量为0.25、0.50、1.00 g·kg-1。试验时使用纯水配制成所需浓度,供动物灌胃给药,小鼠灌胃体积为20 mL·kg-1;氢氯噻嗪片,临床用量为每天1～2 mg·kg-1,本研究小鼠剂量为20 mg·kg-1,实验时使用CMC-Na配制灌胃给药;大黄颗粒,临床用量为每天0.05 g·kg-1,本研究小鼠剂量为2.0 g·kg-1,实验时使用CMC-Na配制灌胃给药;酚磺乙胺注射液,临床用量为每天1.5 g·kg-1,本研究小鼠剂量为1 g·kg-1,使用生理盐水配制腹腔注射给药。

1.4 试剂 活性碳粉(广东台山化工厂,批号:810805);0.9%氯化钠注射液(昆明南疆制药有限公司,批号:A160914 J2);CMC-Na(国药集团化学试剂有限公司,批号:20160602)。

1.5 仪器 JJ-2000型电子天平,美国双杰兄弟(集团)有限公司常熟市双杰测试仪器厂生产、OSB-2000水浴锅,上海爱郎仪器有限公司生产、PL-203电子分析天平METTER-TOLEDO(上海)有限公司生产、ELGA LA 613超纯水机,英国ELGA LabWater/VWS(UK)Ltd生产。

2 实验方法

2.1 兰花草水提取物小鼠急性毒性实验[4-5]根据急性毒性预实验的研究结果,兰花草水提取物的急性毒性试验最大耐受量和最小致死量法。小鼠按体重分层随机分为5个组,每组20只,雌雄各半。分别为正常对照组(N)、兰花草低剂量组(兰花草-D)、兰花草中剂量组(兰花草-Z)、兰花草高剂量组(兰花草-G)、兰花草极高剂量组(兰花草-JG)。各组在禁食不禁水12 h后,兰花草水提取物各剂量组按40 mL·kg-1给药容量灌胃给予相应浓度药物,空白对照组按相同的灌胃容积给予纯水[5]。给药后仔细观察小鼠活动特征4 h并记录,若有死亡小鼠则解剖肉眼观察内脏状况并记录,未死亡小鼠正常饲养14天,每天观察记录。给药后第1天,第3天,第7天和第14天称重,第14天脱椎处死进行解剖观察(心、肝、脾、肺、肾、肠道、胃等),并计算兰花草水提物的最大耐受量和最小致死量。

2.2 实验动物分组及给药 小鼠按体重分层随机分为5个组(小鼠肠推进实验4个组),每组20只(小鼠断尾止血和玻片凝血实验每组14只),雌雄各半。分别为正常对照组(N)、兰花草低剂量组(兰花草-D)、兰花草中剂量组(兰花草-Z)、兰花草高剂量组(兰花草-G)、阳性对照组(氢氯噻嗪/酚磺乙胺/大黄)。兰花草水提取物各剂量组灌胃给予相应药物,阳性对照组灌胃/腹腔注射给予相应阳性药,每天1次,连续7 d,灌胃容量均为20 mL·kg-1,腹腔注射容量为10 mL·kg-1,空白对照组按相同的灌胃容积给予纯水。

2.3 指标检测

2.3.1 兰花草水提取物小鼠利尿实验[6-8]小鼠给药7 d后,正式测量尿液前禁食20 h(不禁水),称重后,先轻压小鼠下腹部10次,排尽余尿,每只小鼠灌胃纯水1 mL作水负荷,随即灌胃给药,记录给药时间,然后将小鼠分别放入自制的漏斗内,下面放置量筒,每一小时测一次尿量,连续观察测量4 h,测量尿液时小心去除落入量筒内的小鼠粪粒,记录数据并进行统计分析。

2.3.2 兰花草水提取物小鼠断尾止血和玻片凝血实验[8～13]小鼠给药7 d后,灌胃30 min后用消毒剪刀横剪小鼠尾端约1 cm血液自行流出计时,每30 s用滤纸吸血一次,当血流自然停止所需的时间为小鼠止血时间。断尾止血后小鼠恢复性饲养两天,同时给以药,两天后进行玻片凝血实验,给药后30 min后用眼科弯镊迅速摘去一侧眼球即有血液流出,弃去第一滴,于载玻片上滴2滴血,血滴直径约5 mm,立即记时,每隔30 s用清洁大头针自血滴边缘向里呈45度角轻轻挑动一滴血1次,并观察有无血丝挑起。若90 s还未出现血丝则挑动第二滴,从采血开始至挑起血丝止,所历时间即为凝血时间,记录数据并进行统计分析。(止血实验和凝血实验均在室温141 ℃的环境下进行。)

2.3.3 兰花草水提取物小鼠泻下实验[14～17]小鼠给药7 d后禁食20 h(自由饮水)后分别灌服上述四种剂量组药液炭末混悬液(0.5 mL/只),含炭末0.1 g·mL-1,空白对照组则用生理盐水配制相同浓度炭末灌服。各鼠分别置于铺有滤纸的集气瓶内观察,记录小鼠排黑便的时间、粪便的性状和数量,以及粪便沾染肛门情况。连续观察6小时,记录并进行数据统计。

2.3.4 兰花草水提取物小鼠肠推进实验[17-20]小鼠给药7 d后禁食20 h(自由饮水),各组灌胃给药或者等体积生理盐水(混有0.5%炭末),20 min后脱颈椎处死,打开腹腔分离肠系膜,剪去上端至幽门、下端至回盲肠部的肠管。不加牵引地将小肠拉成直线,测量肠管长度作为“小肠总长度”。从幽门至炭末前沿的距离作为“炭末在肠内推进距离”。用公式计算炭末推进百分率,比较组间差异。炭末推进率(%)=(炭末推进距离/小肠长度)×100%

2.6 统计分析 所有数据用均数±标准差表示。应用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析统计,两两比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 兰花草水提取物小鼠急性毒性试验 实验结果(表1)显示:14d观察期内16.00 g·kg-1剂量组动物死亡2只,死亡率为10%;13.61 g·kg-1剂量组无动物死亡。对死亡动物进行大体解剖观察,出现肺部充血症状。因未进行组织病理学检查,不能确定肺部充血症状的具体原因。兰花草水提取物小鼠最大耐受量为13.61 g·kg-1,最小致死量为16.00 g·kg-1,其余剂量组小鼠未出现明显地急性毒性反应。

表1 兰花草水提取物小鼠急性毒性试验结果

3.2 兰花草水提取物小鼠利尿实验 实验结果(表2)显示:与正常对照组比较,兰花草水提取物低剂量组和中剂量组小鼠给药后1 h尿量显著增加(P<0.01);兰花草提取物高剂量组小鼠给药后1 h和2 h总尿量均显著增加(P<0.05);且在1 h时尿量最大,后随时间呈递减趋势。与正常对照组比较,兰花草提取物各剂量组小鼠4 h总尿量均显著增加(P<0.01),提示兰花草提取物具有良好的利尿作用。

表2 兰花草水提取物对小鼠利尿作用的影响

3.3 兰花草水提取物小鼠断尾止血和玻片凝血实验 实验结果(图1、图2)显示:与正常对照组比较,兰花草水提取物中剂量和高剂量组小鼠止血时间显著减少(P<0.05),兰花草水提取物各剂量组小鼠凝血时间均有显著降低(P<0.01)。提示兰花草水提取物可能具有良好的止血作用。

图1 兰花草水提取物对小鼠断尾止血作用的影响

图2 兰花草水提取物对小鼠玻片凝血作用的影响

3.4 兰花草水提取物小鼠泻下实验 实验结果(图3、图4、图5)显示:与正常对照组比较,兰花草水提取物中剂量和高剂量组小鼠第一次排黑便时间明显减少(P<0.05或P<0.01);兰花草高剂量组小鼠排黑便数显著增多(P<0.05);兰花草水提取物中剂量和高剂量组小鼠排便总数明显增多(P<0.05)。提示兰花草水提取物可能具有良好的泻下作用。

图3 兰花草水提取物对小鼠泻下作用的影响

图4 兰花草水提取物对小鼠泻下作用的影响

图5 兰花草水提取物对小鼠泻下作用的影响

3.5 兰花草水提取物小鼠肠推进实验 实验结果(图6)显示:与正常对照组比较,兰花草水提取物各剂量组小鼠均未见有明显地促肠推进作用。

图6 兰花草水提取物对小鼠肠推作用的影响

4 讨论

《滇南本草》系云南明代医学家兰茂历经20年所著的一部记载和研究滇南地区特色药材和民族民间用药经验的一部地方性本草学专著。几百年来,在长期实践中,《滇南本草》所载的中草药性味、疗效及用药方法得到证实,被云南省内各民族奉为医药至宝,不仅流传全国各地,且远播国外,促进了我国中医中药的发展。

兰花草是记载于《滇南本草》[1-3]中的一味中药,经查阅书籍和文献报道,对于兰花草药效和毒性研究的文献报道相对较少,根据《滇南本草》中对兰花草的记载,我们推测兰花草可能具有止血、利尿等药效。此外,在开展利尿实验过程中偶然发现兰花草水提取物给药组小鼠排便量均多于空白对照组小鼠,进而又对兰花草水提取物促消化和泻下作用进行了探索。

本文采用经典药理学实验方法中的小鼠断尾止血[4-5]和玻片凝血实验[6]进行兰花草水提取物的止血作用研究,结果发现,兰花草水提取物可以显著减少小鼠断尾止血时间和凝血时间,提示兰花草具有明显地止血作用。利尿实验方法[7-8]众多,包括称重法、输尿管集尿法、家兔导尿管集尿法、代谢笼法和尿液中钠、钾和氯离子的含量测定法等,本文采用代谢笼法,简单易行,实验动物在生理或接近生理状态下进行尿液收集,研究结果较为可靠,结果发现,兰花草水提取物可以显著增加小鼠4 h的总尿量,提示,兰花草具有良好的利尿作用。

兰花草的肠推进和泻下[14]作用研究结果不一致,分析原因可能是实验观察时间不同所致,肠推进作用观察时间为20 min,泻下作用观察时间为6 h。肠推进作用可能更多的是观察肠道蠕动功能,这就与药物的浓度有一定的关系,本文中兰花草水提取物给药组的浓度明显高于正常对照组灌胃的生理盐水,所以在20 min的时间内很难观察到兰花草对肠道蠕动的优势,后续将改变实验方法,再次进行研究。泻下[17]作用不仅仅考察肠道的蠕动功能,还考察药物对小肠和大肠的综合作用。由于观察时间较长,药物可以在肠道内充分吸收,药物浓度对肠道蠕动的影响减少,也可能通过其他途径促进了机体的排泄。

综上所述,初步确立了兰花草水提取物的毒性和药效,兰花草水提取物毒性较低,并验证古书记载,证实兰花草具有利尿和止血作用,同时也发现了兰花草具有显著的泻下作用,为兰花草的开发利用提供了一定的实验依据。