5种中药抗血栓作用对比研究*

叶芮含,尚 李,彭会珍,周志宏,浦仕彪

(云南中医药大学,云南 昆明 650500)

缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)是由脑供血动脉(颈动脉和椎动脉)狭窄或闭塞、脑供血不足,导致局部脑组织缺血缺氧进而损伤坏死,并出现相应的神经功能缺损症状的疾病[1]。近年来,中药制剂治疗缺血性心脑血管疾病的研究已取得了实质性进展,有研究表明,三七总皂苷[2-3]、灯盏花素[4]、天麻素[5]、水蛭[6-7]、龙血竭[8]等中药对神经缺失症状的卒中患者有明显改善作用,并能降低出血和复发的风险。但是,相比之下哪种药物对血栓的作用效果更好目前尚无相关研究报道。因此本研究以上述五种药材为研究对象,针对缺血性脑血管疾病的共同病理基础“血栓形成”,采用多种药效学指标比较各中药的抗缺血性脑卒中效果。

1 材料

1.1 样品

1.1.1 受试物 三七总皂苷,含量>90%;灯盏花素,含灯盏乙素>90%;天麻提取物,提取率0.583%,每克约相当于生药171.5 g;水蛭冻干粉,收率27.1%,每克约相当于鲜品3.7 g;龙血竭粉,西双版纳版纳药业有限责任公司,国药准字Z20063472,生产批号220114,每听装250 g;均由云南中医药大学提供。

1.1.2 对照药品 复方丹参片(国药准字Z53021243,0.32 g/片,60片/瓶,云南白药集团股份有限公司生产,批号ZFA1504),遮光、密封、阴凉处保存。实验时,用0.5%的CMC-Na配制成浓度的混悬液供小鼠灌胃用。

阿司匹林,拜耳医药保健有限公司出品(国药准字H20120237,生产批号:8J14974),100mg/片,30片/盒;按1.5mg/mL的浓度灌胃给药。

灯盏细辛注射液,云南生物谷药业股份有限公司,(国药准字Z53021569,10mL/支,2支/盒,批号20211147),遮光、密封、阴凉处保存,直接使用。

1.1.3 溶媒对照 羧甲基纤维素钠(CMC-Na),化学纯,(国药集团化学试剂有限公司,批号F20200909),用纯水加热、煮沸、冷却后定容配制成0.5%浓度供受试样品配制及溶媒对照用。一次配制,使用5～7 d。

1.2 动物 SPF级ICR小鼠,雌雄兼用,4～6周龄,体重18～26 g,由昆明制药集团动物室提供,生产许可证:SCXK(滇)2014-0001。发证机关:昆明市科学技术局;饲养于IVC动物实验室,温度20～25℃(日温差≤3℃),湿度40%～70%,照明12h:12h明暗交替,照度150～300lx,噪音≤60dB,实验动物使用许可证:SCK(滇)K2013-0004,发证单位:昆明市科学技术局;PVC透明塑料盒群养,每箱≤6只,每日喂饲鼠用配合饲料,自由饮水,视情况更换笼具和垫料,饲料来源于昆明医科大学实验动物中心,生产许可证:SCXK(滇)2011-0004,发证单位:昆明市科学技术局。

1.3 主要仪器 DENVER INSTRUMENT电子分析天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司,d=0.0001 g,用于称量样品及试药;HX602Z型电子天平,慈溪市大东衡器厂,d=0.2 g,用于称量动物体重;248WBJV型海尔冰箱,青岛市海尔股份有限公司;容量瓶、量筒、烧杯、剪刀、秒表、小鼠固定器、毛细管及其它耗材均为国产。

1.4 主要试剂 水合氯醛,国药集团化学试剂有限公司出品,批号:H37022673。使用时,用氯化钠注射液配制成4%浓度,按10mL/kg腹腔注射麻醉小鼠。

角叉菜胶,Sigma公司,生产批号:C101325 g,规格:25 g,按20 mg/kg剂量腹腔注射角叉菜胶10 mL/kg。

二磷酸腺苷(C10H15N5O10P2,ADP),上海源叶生物科技有限公司出品,生产批号:N31M8W37078,存贮:-20℃,规格:5 g。使用时生理盐水配制成250 mg/kg体重,按10mL/kg尾静脉注射。

2 方法与结果

2.1 对小鼠出凝血时间的影响[9]

2.1.1 对小鼠断尾出血时间的影响 选用20～24 g雄性ICR小鼠99只,按体重随机分为9组:溶媒对照;阳性对照阿司匹林30 mg/kg,复方丹参480 mg/kg及灯盏细辛20 mL/kg;三七总皂苷50 mg/kg;灯盏花素20 mg/kg;天麻提取物200 mg/kg;水蛭500 mg/kg;龙血竭500 mg/kg;每组11只。各组动物每日分别按剂量经口灌胃给药1次,连续5 d,溶媒对照组给予0.5%CMC-Na,容积均为20 mL/kg。末次给药后30 min,将小鼠尾尖5 mm处剪断,从出血开始(滤纸上出现血迹)计时,每30秒用滤纸吸去血滴一次,直到出血自然停止(滤纸上无血迹)的时间即为出血时间。结果见图1。

图1 各样品对小鼠出血时间的影响

由图1可见,除天麻提取物外,其余所有给药组均能显著延长小鼠的出血时间,与ASP作用一致,其作用顺序为:ASP>灯盏花素>龙血竭>水蛭冻干>灯盏细辛>复方丹参>三七总皂苷>天麻素提取物。

2.1.2 对小鼠凝血时间的影响 分组及给药同2.1.1试验。末次给药后30min,取内径0.5mm、长10cm毛细玻管自小鼠一侧眼球内眦插入球后静脉丛,至血液流入毛细玻管内开始计时,血液注满后将毛细玻管取出平放于桌上,每隔30秒折断二端毛细管约0.5cm,至血凝丝出现为止的时间即为凝血时间。结果见图2。

图2 各样品对小鼠凝血时间的影响

由图2可见,与溶媒对照组相比各给药组均能显著延长小鼠的凝血时间,其作用顺序为:三七总皂苷>龙血竭粉>天麻提取物>水蛭冻干粉>复方丹参片>灯盏细辛>灯盏花素。

2.2 对小鼠体内血栓形成的影响

2.2.1 对ADP诱导小鼠肺血栓的影响 分组及给药同2.1.1试验。末次给药后30 min,按文献[10]方法于小鼠尾静脉注射250 mg/kg的二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)生理盐水溶液10 mL/kg,观察并记录15min内各组动物的死亡数,按下式计算存活率。结果见图3。

图3 各样品对样品对ADP诱导小鼠肺血栓的影响

存活率(%)=(动物总数-死亡数)/动物总数

由图3可见,所有给药组均能明显提高ADP诱导肺血栓形成小鼠的存活率,其作用顺序为:灯盏细辛>水蛭冻干粉 = 复方丹参片>三七总皂苷=灯盏花素=龙血竭粉>天麻提取物>ASP。

2.2.2 对角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓形成的影响 选用18～20 g雄性ICR小鼠144只,按体重随机分为12组:溶媒对照;阳性对照阿司匹林30 mg/kg;三七总皂苷50、200 mg/kg;灯盏花素20、80 mg/kg;天麻提取物200、800 mg/kg;水蛭500、2000 mg/kg;龙血竭500、2000 mg/kg;每组12只。各组动物每日分别按剂量经口灌胃给药1次,连续5 d,溶媒对照组给予0.5%CMC-Na,容积均为20 mL/kg。末次给药后30 min,每鼠按20 mg/kg剂量腹腔注射角叉菜胶10 mL/kg,造模24 h后观察每鼠尾部血栓形成情况,计算各组小鼠的血栓形成率,并按下式计算血栓形成抑制率[11]。结果见表1。

表1 系列样品对角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓形成的影响

抑制率(%)=(对照组形成率-给药组形成率)/对照组形成率

由表1可见,所有给药组均能不同程度抑制角叉菜胶诱导小鼠的尾部血栓形成率,除灯盏花素高剂量和水蛭冻干的高低剂量组仅有作用趋势外,其余各组与对照组相比均有显著统计学差异;作用顺序为:三七总皂苷低剂量=天麻提取物低剂量=龙血竭低剂量>ASP =三七总皂苷剂高量=灯盏花素低剂量=天麻提取物高剂量=龙血竭高剂量>水蛭低剂量=灯盏花素高剂量>水蛭高剂量;各样品低剂量组作用强于高剂量。

2.3 对急性脑缺血的影响

2.3.1 对断头脑缺血小鼠张口喘息时间的影响[12]选择20-22 g雄性ICR小鼠144只,分组及给药按2.2.2试验。末次给药后30 min,用利器将小鼠快速断头,观察并记录小鼠断头后张口喘息的持续时间为耐受脑缺血缺氧时间。结果见图4。

图4 各样品对断头小鼠张口喘气时间的影响

由图4可见,除ASP组仅有一定作用趋势(P>0.05)外,其余给药组均能显著延长断头小鼠的张口喘息时间(P<0.05/0.01),提示对急性脑缺血缺氧有一定的保护作用;作用顺序为:天麻提取物高剂量>水蛭高剂量>天麻提取物低剂量>三七总皂苷剂高量>三七总皂苷低剂量>灯盏花素低剂量>灯盏花素高剂量>水蛭低剂量>龙血竭低剂量>龙血竭高剂量>ASP。

3 结论

中药用于抗缺血性脑卒中治疗已有多年,本研究检测的中药在临床应用中也有较多报道。本文运用临床治疗缺血性脑卒中的5种药材的6个样品进行抗凝、抗血栓及抗脑缺血缺氧作用初步比较实验,结果表明各样品均有抗血栓及脑保护作用,但侧重点有所差异。在抗凝及抗血栓对比实验中,三七总皂苷的活性最好,而药物的物质基础是发挥其药理作用的关键,三七总皂苷是三七主根或根茎中的主要成分,包括三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd[13],但对其有效成分在缺血性脑卒中的干预机制缺乏系统性研究。并且是否是由于各中药的有效成分不同,才使其治疗效果有所差异有待进一步研究。因此认为,若主要针对抗凝及抗血栓的单一药物治疗可以首选三七,若要组方治疗下一步可以考虑对其进行组方配比研究评价。