丁香酚对褐菖鲉的麻醉效果

陈欣怡，王好学，徐开达，李鹏飞，周永东

（1.浙江海洋大学海洋与渔业研究所/2.浙江省海洋水产研究所，农村农业部重点渔场渔业资源科学观测实验站，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江 舟山 316021；3.浙江海洋大学水产学院，浙江 舟山 316022）

褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）隶属硬骨鱼纲（Osteichthyes）鲉科（Scorpaenidae）菖鲉属（Sebastiscus），俗称石头鲈、石九公等[1]，其营养价值丰富，是沿海重要的经济鱼种[2-3]。近年来由于人类过度捕捞，褐菖鲉资源衰退严重，为补充其资源量，相关部门已连续多年开展增殖放流活动[4]，有研究表明增殖放流过程中标志、运输等环节可能引发鱼体应激造成损耗[5]，且褐菖鲉受到外部刺激时背部硬鳍条会竖起展开，容易使操作人员受伤，不利于相关生产活动和实验操作开展。杨州等[6-7]指出合理使用麻醉剂可以抑制麻醉对象中枢神经，使其在一定时间内进入低消耗休眠状态，从而在受外界刺激时减少应激反应，降低损伤及致死危害，有利于提高鱼苗放流的成活率。因此，研究麻醉剂对褐菖鲉的麻醉效果有重要实际意义。

目前鱼用麻醉剂有包括丁香酚、MS-222、苯唑卡因等十几种[8-9]，其中丁香酚不仅价廉易得，而且麻醉效率较高，其代谢物能够快速从血液和组织中排出，不会对海洋生物和人体造成毒害影响[10]，在牙科医学镇痛及水产动物麻醉方面应用广泛[11-12]。丁香酚用于各类鱼种的麻醉研究已见诸多报道，包括大黄鱼（Larimichthys crocea）、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）、大口黑鲈（Micropterus salmoides）、刀鲚（Coilia nasus）、暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）等30 多种[13-23]，上述研究发现麻醉不同鱼种适用的丁香酚质量浓度存在较大差异，且丁香酚对褐菖鲉的麻醉效果未见报道，因此本研究开展褐菖鲉在不同浓度丁香酚作用下的麻醉复苏实验以及麻醉后不同空气暴露时长的影响实验，以期为进一步优化褐菖鲉标志放流技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

使用样品为浙江省舟山市西轩渔业科技岛培育的褐菖鲉苗种，体长（88.12 ± 4.87）mm，体质量（19.58 ± 3.30）g，实验用鱼达到标志放流标准规格[24]，鱼体健康，体质强健。实验前15 d分别暂养于15 个200 L 白色圆形养殖桶，每日上午8 点及下午5 点喂食，实验前2 d停止投喂。实验所用为自然海水，海水温度为（15.7 ± 0.5）℃，经过滤处理引入养殖桶。麻醉剂为常熟尚齿齿科材料有限公司生产的质量分数96%丁香酚，淡黄色油状液体，难溶于水，需无水乙醇助溶。

1.2 实验方法

1.2.1 麻醉剂配制 以丁香酚、无水乙醇按体积比1∶9 的配制母液，随配随用。实验时根据所需浓度在20 L的洁净塑料盆中用海水稀释母液。

1.2.2 麻醉/复苏阶段及行为特征 褐菖鲉麻醉及复苏过程参考彭宁东等[25]和刘长琳等[26-27]研究结果，将麻醉阶段分为Ⅰ-Ⅵ期（表1），复苏阶段分为Ⅰ-Ⅳ期（表2）。在不同质量浓度丁香酚溶液中分别浸浴2 尾实验鱼，选择麻醉行为分期较明显的质量浓度50 mg/L 进行褐菖鲉行为特征观察，实验鱼每组6尾，设3组平行，一半观察至Ⅵ期麻醉（鱼体死亡），一半达到Ⅳ期麻醉后立即从丁香酚溶液转移至自然海水复苏，重复3 次，观察并对褐菖鲉麻醉/复苏各阶段进行行为特征描述（表1、表2），并以此作为后续实验判断麻醉与复苏阶段的标准。

表1 褐菖鲉麻醉过程分期及行为特征Table 1 Anesthesia stage and behavior characteristics of Sebastiscus marmoratus

表2 褐菖鲉复苏过程分期及行为特征Table 2 Stages and behavioral characteristics of recovery process of Sebastiscus marmoratus

1.2.3 最终麻醉程度 根据预实验结果，设计10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、150和180 mg/L 共12 个质量浓度梯度，各梯度实验用鱼5 尾，设置3 组平行组，因低质量浓度麻醉剂褐菖鲉入麻时间较长，由此设定最长浸浴时间为30 min，并在3、5、10、15、20 和30 min 时观测记录各质量浓度下褐菖鲉的麻醉程度。结果表明丁香酚质量浓度低于30 mg/L时褐菖鲉不能在3 min 内入麻，质量浓度在50～180 mg/L 时，30 min 内均出现不同程度的死亡情况。

1.2.4 麻醉、复苏时间测定 预实验得出各质量浓度组褐菖鲉全部麻醉至多需要4.4 min，全部复苏至少需要6.9 min，综合考虑褐菖鲉复苏时间较其他鱼种更长的特点，本实验设定3 min 内麻醉，7 min 内苏醒，麻醉15 min 后存活率100%为有效麻醉浓度。结合实验1.2.3 的结果以及相关文献[28]，选取30、40、50、60、70、80 mg/L 共6 个质量浓度的丁香酚溶液分别测定褐菖鲉入麻与复苏所需的时间，各组实验用鱼12尾，设置3个平行组。

1.2.5 空气暴露时长对褐菖鲉复苏的影响 对比上述实验中褐菖鲉的麻醉/复苏时间，选定麻醉剂质量浓度为40 mg/L，以此设计空气暴露实验，预实验得出致死空气暴露时间为（49.9 ± 8.1）min，因此设最长空气暴露时间为60 min，实验鱼在40 mg/L 丁香酚溶液中浸浴至Ⅳ期麻醉后捞出置于湿润毛巾，再覆盖一层湿毛巾仅使头部暴露在空气中。各实验组分别暴露3、5、10、15、20、30、45、60 min 后放入自然海水观察复苏情况并记录完全复苏所需时间，另设置一组实验鱼在进入Ⅳ期麻醉后空气暴露至无生命体征，记录致死时间。复苏时间以褐菖鲉出现复苏特征（平衡恢复期）的时间判断苏醒状况，实验结果以平均值± 标准差表示，复苏率为完全复苏个体占实验个体总数的比例。

1.2.6 数据处理 本实验所得数据使用Microsoft Excel 2016、Origin Pro 2021 和SPSS 进行统计分析及多重比较，描述性统计结果用平均值±标准差来表示，显著性水平α为0.05（差异显著）和0.01（差异极显著）。

2 结果与分析

2.1 30 min内不同质量浓度丁香酚溶液下褐菖鲉的最终麻醉程度

由图1可知，浸浴时长为30 min时，所有组别均能达到Ⅳ期（麻醉状态），10～40 mg/L 最终麻醉程度为Ⅴ期深度麻醉，50 mg/L 及以上质量浓度最终麻醉程度能达到Ⅵ期（鱼体死亡）且均为部分实验鱼为Ⅴ期，部分实验鱼为Ⅵ期，其中10、20 mg/L 组部分实验鱼为Ⅳ期，部分实验鱼为Ⅴ期，30 和40 mg/L 组全部实验鱼为Ⅴ期深度麻醉，麻醉程度高的实验鱼占比基本随麻醉剂浓度升高而增大。

一定质量浓度的丁香酚溶液中，浸浴时间越久麻醉程度越高，致死概率越大。麻醉5 min 内仅有180 mg/L 组出现少部分死亡，麻醉30 min 时50～180 mg/L均出现不同程度死亡，其中120～180 mg/L丁香酚溶液中浸浴30 min 死亡率高达90%。由结果得出，若需在短时间内麻醉褐菖鲉可选择40～150 mg/L 的丁香酚溶液；若需褐菖鲉较长时间保持麻醉状态可选择10～40 mg/L 的丁香酚溶液，麻醉时间控制在30 min之内较为合适。

2.2 麻醉、复苏时间及有效质量浓度的确定

由图2 可知，褐菖鲉麻醉所需时间随丁香酚质量浓度上升基本呈减少趋势，质量浓度在40 mg/L时麻醉所需时间明显减少，30 mg/L组麻醉所需时间与其余组差异极显著（P＜0.01），40 mg/L 组与60～80 mg/L 组差异显著（P＜0.05），50 mg/L 组与70～80 mg/L 组差异显著（P＜0.05）；丁香酚质量浓度在30～40 mg/L 时，褐菖鲉复苏所需时间随丁香酚质量浓度上升基本呈减少趋势，质量浓度40～70 mg/L 之间，复苏时间基本呈增加趋势，质量浓度在40 mg/L 和80 mg/L 时，复苏时间明显减少，分析得出：40 mg/L 组复苏时间与60～80 mg/L 组差异显著（P＜0.05），50 mg/L 与80 mg/L 组差异显著（P＜0.05），70 mg/L 组复苏时间与其余组差异极显著（P＜0.01）。

30 mg/L 丁香酚溶液用于麻醉褐菖鲉浓度偏低，无法使其在1.2.4设定的有效麻醉浓度判定标准（3 min）内全部进入Ⅳ期麻醉，在30、60～80 mg/L丁香酚溶液中，褐菖鲉无法在7 min 内全部复苏，且由2.1 可知，只有当丁香酚质量浓度小于60 mg/L时，褐菖鲉在麻醉剂中浸浴15 min 后没有出现死亡，成活率达到100%，因此，丁香酚麻醉褐菖鲉的适宜浓度范围为40～50 mg/L。

2.3 空气暴露时长对褐菖鲉复苏的影响

根据2.2 实验结果选取40 mg/L 的麻醉浓度进行实验，结果显示，褐菖鲉在该质量浓度丁香酚溶液中浸浴（2.90 ± 0.46）min 均能进入Ⅳ期麻醉。由图3 可知：褐菖鲉空气暴露后复苏率自20 min 起呈下降趋势，空气暴露30 min 时，复苏率为87.5%；空气暴露45 min 存活率为83.3%；空气暴露60 min，实验鱼全部死亡。空气暴露3～20 min 内，各组复苏时间差异不显著（P＞0.05），空气暴露30 min 与5～20 min 组复苏时间差异显著（P＜0.05），空气暴露45 min与其余组差异均显著（P＜0.05）；空气暴露时间在15 min以内，平均复苏时间随空气暴露时间延长而缩短，最快入水3 s 即可正常游动；空气暴露15～45 min 时，平均复苏时间随空气暴露时间延长逐步增加，且复苏率逐步降低，观测到最长复苏时间为13.54 min。根据平均复苏时间变化趋势推测，空气暴露15 min 时褐菖鲉可将麻醉剂基本代谢从而逐渐复苏，因此今后若需进行离水操作研究，建议将操作时间控制在15 min 以内，避免褐菖鲉应激造成损害。

图3 空气暴露时间对褐菖鲉复苏时间及复苏率的影响Fig.3 The effect of air exposure time on recovery time and recovery rate of Sebastiscus marmoratus

3 讨论

3.1 丁香酚对褐菖鲉的麻醉效果

从实验结果（图1和图2）可以看出，丁香酚质量浓度在50 mg/L 时，褐菖鲉最终麻醉程度能达到Ⅵ期麻醉，且麻醉时间随麻醉剂质量浓度逐渐增加而逐渐缩短，复苏时间基本随麻醉剂质量浓度逐渐增加而逐渐增加，这与其他鱼类研究结果相一致[29-30]。但出现质量浓度30 mg/L 组实验鱼复苏时间长于40 mg/L组，70 mg/L组实验鱼复苏时间长于80 mg/L组的情况。金元等[31]指出麻醉时间过长会导致鱼体吸收麻醉剂含量超出可承受临界值而出现毒性致死现象，而麻醉剂质量浓度过低时需耗费更长时间进入麻醉状态使得更多麻醉剂进入鱼体各组织，因此30 mg/L 质量浓度实验鱼需要耗费比40 mg/L 组更长时间代谢麻醉剂，同理80 mg/L 组由于浓度高，实验鱼进入麻醉耗费时间少，吸收的麻醉剂剂量少，因此恢复得更快。通常来说，麻醉时间越长麻醉浓度越大，鱼体出现死亡可能性越大，但图1中部分组别如10 min 时的80、90 mg/L 组，20 min 时的70、90、120 mg/L 组，30 min 时的60、90 mg/L 组出现死亡率低于相邻浓度组，推测其原因为实验鱼个体差异，因此尽量选择体格相似的同批鱼苗以控制实验变量。

3.2 关于丁香酚麻醉褐菖鲉的有效质量浓度

丁香酚主要是通过鳃丝或体表被鱼体吸收进入血液循环，通过抑制脑皮质的中枢神经系统致使其触觉麻痹，再作用于基底神经节和小脑，最后作用于脊髓，使鱼体全身麻醉[32-33]。有研究表明硬骨鱼类的最适麻醉质量浓度基本在20～100 mg/L 之间[26]，本实验得出丁香酚对于标志规格褐菖鲉的有效麻醉质量浓度范围为40～50 mg/L，研究结论高于大黄鱼5～10 mg/L[14]、锦鲤（Cyprinus carpio）15～20 mg/L[30]、斑马鱼（Danio rerio）20 mg/L[19]等，低于俄罗斯鲟（Acipenser gueldenstaedti）80～100 mg/L[34]，推测由于不同鱼种神经生理特性存在差异[35]，其机体内部交互信息传递有一定区别导致麻醉剂作用于各部位存在时间差，使得不同鱼种对同种麻醉剂的敏感程度有所区别[36]。对不同质量浓度丁香酚作用下褐菖鲉的麻醉复苏时间进行线性回归分析发现，一定范围内的丁香酚质量浓度会对麻醉所需时间产生极显著负向影响关系（P＜0.01），对复苏时间有极显著正向影响关系（P＜0.01），因此需缩短麻醉时间时可适度增加丁香酚质量浓度。

此外，鱼种、鱼体规格、成熟度等都会影响适宜的麻醉质量浓度，其中鱼体规格及成熟度影响最为显著。通常大型鱼需要的麻醉浓度高于小型鱼，鱼龄越大，需要的麻醉剂浓度更高但复苏率低[37]。本实验选取的实验鱼为标志放流规格的褐菖鲉幼鱼，平均体长（88.22 ± 5.69）mm，日常增殖放流工作还包括更小规格的鱼苗，因此可增加丁香酚对该鱼种更多不同规格鱼苗的麻醉实验。

3.3 关于空气暴露时间对褐菖鲉复苏的影响

在进行标志取血、测量取样等研究操作过程中需要鱼体短暂离水，未经麻醉处理进行急性离水操作易造成不同程度的鳃组织永久性损伤、肌肉组织结构改变等[38]，麻醉后进行离水操作对其生理影响相对较小[39]。褐菖鲉经40 mg/L 的丁香酚麻醉后，随空气暴露时间延长，平均复苏时间呈现先缩短后延长的趋势：空气暴露时间在3～15 min 时，实验鱼复苏所需时间随暴露时间延长而逐渐缩短；空气暴露时间在15～45 min 时，实验鱼复苏所需时间随暴露时间延长而逐渐延长；空气暴露60 min 时，实验鱼无法复苏。由于许多硬骨鱼类除鳃呼吸外还可通过皮肤呼吸进行部分代谢[40]，推测鱼体在空气中由皮肤代谢了一定量丁香酚使得体内麻醉浓度降低，从而逐渐复苏，因此在15 min 以内，平均复苏时间随空气暴露时间增加而缩短，15 min 之后由于鱼体基本达到复苏阶段，但长时间离水导致缺氧或短暂休克，需要一定时间恢复正常生理活动，因此复苏时间随之延长。虽然麻醉后褐菖鲉在空气中耐受时间较长，但考虑到缺氧会对鱼体造成生理损害，且进入复苏阶段鱼体逐渐活跃不易于进行各种操作，因此今后若进行需鱼体长时间离水的实验研究，建议麻醉后注意把握时间，尽量将离水过程控制在15 min以内。