联合二代和三代测序技术鉴定新冠病毒

林 琦,黄枝妙,曾志伟,陈 炜,陈明建,翁育伟

新型冠状病毒感染(Coronavirus Disease 2019, COVID-19)是由新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的急性呼吸道传染病。SARS-CoV-2属于β属冠状病毒,主要通过呼吸道飞沫和密切接触等途径传播[1-3]。随着全球COVID-19持续流行,SARS-CoV-2不断发生变异并导致其传播力和致病性发生改变。目前,Omicron变异株已成为国内外主要流行毒株,虽然在流行过程中其致病力明显减弱,但其潜伏期缩短(2～4 d)、传播力变强、传播速度变快,免疫逃逸能力增强,对全球COVID-19防控提出了新挑战[4-5]。

及时发现各种SARS-CoV-2的新型变异株,了解其生物学及流行病学特征,是当前COVID-19防控的重要手段,因此高通量测序技术大量应用于新冠疫情防控工作中。目前,SARS-CoV-2高通量测序主要包括Illumina[6]、Ion Genestudio S5[7]和MGI[8]等二代测序平台,以及Oxford nanopore[9]和Pacific bioscience[10]等三代测序平台。其中Illumina和Oxford nanopore使用的更为广泛。不同测序平台的测序结果各有优缺点,如以Oxford nanopore为代表的三代测序平台的测序速度快,但其测序的精度尚有不足;而以Illumina为代表的二代测序平台的测序精度高,但耗时较长,测序过程相对复杂[11-12]。在新冠防控工作具体实践特别是在新冠疫情处置中,对测序要求既要“快速”又要“精准”,因此需要兼顾测序的实效性和精确性。本研究采用三代和二代测序联用的方式,测定了福建省2例BQ.1进化分支病毒感染的输入性COVID-19的病毒全基因组序列,并对其进行了变异和进化分析。在及时准确判断病毒变异类型的前提下,为研判和预测疫情提供了准确的病原学信息。

1 材料与方法

1.1 病例基本信息 病例A和B均为男性,波兰人,年龄分别为65岁和63岁,同为某船务代理公司船员。病例A已接种4剂次辉瑞mRNA新冠疫苗,病例B疫苗接种史不详。两病例于2022年10月6日从波兰抵达上海并隔离,10月16日从上海乘机抵达福州市,随后由专车接往宁德市,入住酒店后均未外出。两病例10月18日核酸检测结果为阳性,均无明显发热、咳嗽、流涕等症状。两病例的鼻咽拭子标本被送至福建省疾病预防控制中心进行全基因组测序。

1.2 核酸提取及real-time RT-PCR复核 使用磁珠法核酸提取试剂盒(货号:T014,西安天隆)提取阳性病例鼻咽拭子标本中的病毒RNA。利用SARS-CoV-2核酸检测试剂盒(货号:DA0932,广州达安)对提取的RNA进行real-time RT-PCR复核。留取复核后的阳性核酸于-80 ℃保存备用。

1.3 病毒全基因组测序 使用二步法长片段新冠病毒全基因组捕获试剂盒(货号:BK-WCoV024IITS,杭州柏熠)进行病毒全基因组扩增,按照Rapid Barcoding Kit(货号:SQK-RBK004,Oxford Nanopore)操作步骤构建三代测序文库,使用Oxford Nanopore MinION MK1C三代测序仪进行测序,采用柏熠新冠病毒全基因组分析系统对测序数据进行质控和病毒全基因组序列拼接。二代测序采用ULSEN超灵敏度新型冠状病毒全基因组捕获试剂盒(货号:V-090418-1,北京微未来)进行病毒全基因组扩增,按照Nextera XT DNA Library Preparation Kit(货号:FC-131-1096,Illumina)操作步骤构建二代测序文库,使用Illumina Miseq二代测序仪进行测序,以Wuhan-Hu-1(NC_045512.2)基因组作为参考序列,使用CLC Genomics Workbench软件(ver.23.0)对测序数据进行病毒全基因组序列组装拼接。

1.4 全基因组序列分析 使用SARS-CoV-2分型系统Pangolin(https://pangolin.cog-uk.io/)对测定的病毒全基因序列进行分型[13-14];通过在线工具Nextclade(https://clades.nextstrain.org/)对序列拼接结果进行质量检查;从GISAID(https://www.gisaid.org)上筛选和下载同源序列以及不同Omicron亚分支变异株的代表序列作为参比序列,采用MAFFT软件(ver.7.0)(https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)进行多序列比对,使用MEGA软件(ver.6.0)的NJ法(Bootstrap=1000)构建系统进化树;使用Interactive Tree Of Life (https://itol.embl.de/)对进化树进行注释;使用Nextclade的SARS-CoV-2变异分析模块对病毒全基因组序列进行核苷酸与氨基酸突变分析、ACE2受体亲和力及免疫逃逸能力预测[15]。

2 结 果

2.1 核酸复核结果 Real-time RT-PCR检测病例A和B的鼻咽拭子核酸提取物,结果均为SARS-CoV-2核酸阳性,复核后的Ct值(ORF1ab/N)分别为:27.51/25.41、19.75/18.86,均满足COVID-19诊疗方案(第九版)[16]要求的病毒全基因组测序标准。

2.2 全基因组测序 采用三代测序技术从病例A的鼻咽拭子标本中测得1株SARS-CoV-2全基因组序列,序列长度为28 910 bp,基因组覆盖度为89.8%(<99.0%),平均测序深度为1 129×,Pangolin分型结果显示病例A感染病毒属于Omicron变异株BQ.1亚分支,但质控分析显示三代测序所获序列存在基因组覆盖度不足、因重复性碱基测序缺失引起的氨基酸翻译错误(移码)等问题(详见表1)。采用二代测序技术从两病例标本中测得2株SARS-CoV-2全基因组序列,序列长度分别为29 665 bp和29 682 bp,基因组覆盖度分别99.3%和99.6%(均>99.0%),平均测序深度分别为2 973×和3 695×,Pangolin分型结果均为Omicron BQ.1变异株,与三代测序病毒分型结果一致;质控分析显示二代测序所获2株SARS-CoV-2全基因组序列的完整度、基因组覆盖度、测序深度、刺突蛋白(S蛋白)完整性等均较好,氨基酸翻译正确无移码,表明二代测序获得的2株病毒序列均属于高质量序列,详见表1。

表1 SARS-CoV-2全基因组测序质量分析结果

2.3 全基因组进化分析 根据病毒的分型结果,从GISAID数据库中筛选并下载同源序列及不同Omicron亚分支的代表性序列作为参比序列,包括:BQ.1、BA.3、BA.4、BA.5、BA.5.1、BA.5.2、BA.5.3、BA.5.3.1、BF.7、XBB等10种Omicron亚分支。以Wuhan-Hu-1(NC_045512.2)作为“树根”(Root),将筛选出的68条参比序列与2株SARS-CoV-2基因组序列构建系统进化树。结果显示,2株SARS-CoV-2基因组序列(2022XG-2599、2022XG-2600)共同处于Omicron变异株BQ.1进化亚分支上,且位于同一进化簇,表明2株SARS-CoV-2高度同源,见图1。

注:●表示武汉参考株序列Wuhan-Hu-1(NC_045512.2);▲表示本研究2株SARS-CoV-2全基因组序列;10种不同的Omicron亚分支序列用不同背景色显示,亚分支名称标注在环形进化树外侧。

2.4 全基因组突变分析 用二代测序结果进行SARS-CoV-2全基因组突变分析。结果显示,同Wuhan-Hu-1相比,2022XG-2599(病例A)全基因组序列共有77个核苷酸突变位点(不计缺失/插入突变),其中1个突变位点位于5′UTR区域,76个突变位点位于蛋白编码区。蛋白编码区核苷酸突变涉及8种病毒蛋白编码序列,包括2种非结构蛋白、4种结构蛋白和2种辅助蛋白。蛋白编码区核苷酸突变导致57个错义突变和19个同义突变,主要突变发生在S蛋白(32个)、ORF1a蛋白(18个)、ORF1b蛋白(10个)和 N蛋白(7个)编码区。在2022XG-2599全基因组氨基酸突变中,除S蛋白区A27S突变和第24-26位氨基酸缺失外,其余突变均属于Omicron变异株BQ.1亚分支的特征性氨基酸突变(75%以上该型别变异株共有的突变位点);同时S蛋白中的氨基酸突变中有19个位于受体结合域(receptor binding domain,RBD)(详见表2)。2022XG-2600(病例B)序列与2022XG-2599虽然在全基因组长度及覆盖度上有微小差异(序列长度相差17 bp,覆盖度相0.3%),但二者共享全部核苷酸与氨基酸突变位点(详见表2)。

2.5 受体亲和力及免疫逃逸能力预测 通过Nextclade在线预测本研究2株SARS-CoV-2的RBD氨基酸突变对人体细胞表面血管紧张素转换酶2(angiotensinconverting enzyme 2,ACE2)受体的亲和力及逃避中和抗体识别能力(免疫逃逸)的影响。结果显示,以Omicron变异株BA.2亚型为参照毒株,2株SARS-CoV-2的ACE2受体亲和力评估值均为0.66,即ACE2受体的亲和力比BA.2亚型高出约4.6倍(10∧0.66≈4.6);以Omicron变异株BA.2亚型为参照毒株, 2株SARS-CoV-2的中和抗体逃逸能力评估值均为0.63,即只保留了约53.3%(e∧0.63≈0.533)BA.2亚型的抗体中和活性。预测结果表明本研究2株SARS-CoV-2较Omicron变异株BA.2亚型可能在ACE2受体亲和力和免疫逃逸能力方面均有明显提升。

3 讨 论

本研究联合采用Illumina Miseq(二代测序)和Nanopore MinION(三代测序)两种高通量测序技术,成功自2例COVID-19病例鼻咽拭子标本中获得SARS-CoV-2全基因组序列,分型结果显示2株病毒均属于Omicron BQ.1变异株,为福建省内首次鉴定到的BQ.1病例;同时结合流行病学资料,推测两例病例可能自境外输入,并暴露于同一传染源。本研究采用三代测序对标本进行测序,从核酸提取到获得病毒全基因组序列仅用7 h,能够初步鉴定出病毒型别属于Omicron变异株BQ.1进化分支,但仅成功测得1例病例病毒序列,且基因组覆盖度低于99.0%,不能准确分析病毒全基因组突变情况;采用二代测序则成功获得两例病例的病毒基因组序列,且基因组覆盖度和测序深度均优于三代测序,分型结果与三代测序一致,为后续基于突变的病毒精准溯源提供可靠的数据基础,但耗时相对较长(20～22 h)。尽管Nanopore三代测序偶尔会出现连续碱基区域测序缺失的问题,使其测序准确度受影响,但由于其耗时相对较短(6～8 h),因此能够在疫情暴发初期迅速鉴别新型变异株,有利于第一时间发现感染源[17]。Illumina二代测序虽然耗时较长,但其测序错误率相对较低,能够更准确分析病毒全基因组的突变情况,有利于精准分析病毒传播链和研判疫情传播态势。本研究结合不同测序技术的优点,将三代和二代测序技术联用,既满足了测序的时效性又解决了测序的准确性问题,这种测序模式能够从不同应用层面更好地为疫情风险评估、流行病学监测及公共卫生决策提供技术支持。

2022年7月,尼日利亚首次报道了Omicron变异株BQ.1亚型感染病例,之后BQ.1便在欧洲和北美迅速扩散,BQ.1是Omicron变异株BA.5分支在人群流行过程中变异产生的亚分支,该变异株在S蛋白的一些关键抗原位点上发生突变,这些突变赋予其免疫逃逸优势,使其具有较高的再感染和疫苗突破潜力,可能会导致全球范围内的感染和死亡病例数量激增,将对公共卫生安全构成新的威胁[18-19]。WHO将BQ.1变异株定义为VUMs(Currently circulating variants under monitoring)[20],WHO的统计数据显示[21],2023年第3～7周,BQ.1系列变异株在所有VUMs中的周流行率为20.03%～36.40%,已累计在133个国家检测到。BQ.1变异株的S蛋白在BA.5变异株基础上新增K444T和N460K特征性突变位点,本研究2株BQ.1变异株在RBD区均含有这2个突变位点,有研究显示[22],K444T和N460K的组合突变拓展了氢键相互作用的网络,可能有利于对中和抗体的抵抗,从而增强了其免疫逃避能力。RBD是介导S蛋白与ACE2受体结合和诱导宿主免疫系统产生中和抗体的重要结构域,该结构域突变可能会导致病毒免疫逃逸能力增强和影响疫苗免疫效果[23-24]。本研究2株BQ.1变异株在RBD区包含19个氨基酸突变,其中K417N、L452R、S477N、N501Y等是WHO定义的MOI(Mutation of Interest)位点,对其人群适应性具有重要作用[25-26]。相关研究发现[27],Omicron变异株可能通过RBD区氨基酸残基组合的趋同突变来逃避抗体的中和作用,同时又保持足够的ACE2结合能力,如N460K、F486V与N460K组合、L452R与F486S/V组合、K444N/T与F486V组合等。本研究2株BQ.1变异株在RBD区出现了K444T、L452R、N460K、F486V等热点突变,这些突变的不同组合可能对变异株的免疫逃避能力和ACE2受体亲和力产生趋同作用。这与在线软件预测的2株BQ.1变异株的ACE2受体亲和力及免疫逃逸能力结果一致,表明变异株的生物学特性可能发生较明显变化,需给予持续监测。当前SARS-CoV-2疫苗保护效力及BQ.1变异株可能导致突破性感染和再感染风险还需要进一步研究。

当前我国疫情防控已进入新阶段,随着入境政策的优化调整,更多SARS-CoV-2新型变异株将持续输入国内并引起本土流行传播,通过对具有代表性的新冠病毒感染者样本进行病毒全基因组测序和突变分析,可以动态监测本土流行的变异株组成和分布,及时发现国内外重点关注变异株,评估变异株的传播力、致病力和免疫逃逸能力等变化和风险研判,为本土新增SARS-CoV-2变异株的大规模传播提供早期预警。本研究采用二代和三代测序技术联用进行病毒基因组测序,兼顾了准确性和时效性,可为SARS-CoV-2变异监测工作及制定疫情防控策略提供技术参考与支持。

利益冲突：无