副溶血性弧菌的3种分子分型方法研究

李 雪,孙婷婷,魏彤竹,王伟杰,刁文丽

副溶血性弧菌可引发人类与海产品相关的肠胃炎,是一种嗜盐性革兰氏阴性细菌。近5年来,由副溶血性弧菌引起的食物中毒病例增多,甚至出现死亡病例,已引起相关部门的重视[1]。

副溶血性弧菌由藤野在1950年首次分离,菌种鉴定主要依据血清分型、生化反应、噬盐性试验、神奈川现象、动物实验等。鉴定项目多,培养基消耗大,实验操作繁琐,检验耗时长,给实际工作带来不便。

血清分型是副溶血性弧菌分型的常用方法,副溶血性弧菌一般有13个血清O群和71个K型抗原,但很多VP分离株不能用现有的抗原分型,当出现新的血清型时就可能给食源性疾病流行病学调查和溯源带来困难,因此作为流行病学研究工具,血清分型是很受限制的[2-3]。血清分型于副溶血性弧菌亚型的区分和流行病学调查相对不敏感。这就需要更具辨别能力的分子分型方法对副溶血性弧菌进行亚型分析和溯源。细致的分子分型研究及副溶血性弧菌菌株间亲缘关系的探讨可为副溶血性弧菌的预防、控制、流行病学调查、协助追踪感染源等工作提供重要理论依据[4-7]。

脉冲场凝胶电泳(PFGE)具有分辨力高、重复性好的优点,已经应用在很多食源性致病菌的分子分型研究中。PFGE的原理在于凝胶中应用交错电场,使DNA的运动方向变化,从而使大分子量DNA可以被更好的分离,研究者根据条带来进行鉴定与溯源等工作。

REP-PCR和ERIC-PCR技术是利用细菌基因组中广泛分布的短重复序列为引物的靶序列进行PCR扩增,通过对PCR产物电泳结果的比较,即可分析菌株间基因组存在的差异。这些重复序列在原核生物界广泛存在,在一些细菌属和种中是保守的。该技术对于大量或少量的菌株分型均适用,简单易行。与其他分类技术相比,这种技术有更高的分辨力。

本研究对2020年辽宁省副溶血性弧菌进行3种分子分型方法研究,探讨3种方法间的关联性和菌株间的亲缘关系,分析辽宁省副溶血性弧菌的流行趋势及分布规律,为食源性疾病的防控提供可靠的技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌株 海产品采自2020年辽宁省14个市的农贸市场。粪便样品来源于2020年辽宁省内食源性疾病监测医院食物中毒病人。

采集海产品和粪便样品进行VP增菌、分离和鉴定,得到食品分离株22株和临床分离株22株,44株菌全部由省疾控中心用全自动微生物生化鉴定仪鉴定为VP。ATCC 17802(来源于辽宁省疾控中心),PFGE实验分子量标准菌株SalmonellaBraenderupH9812来自于国家食品安全风险评估中心。

1.2 主要仪器与试剂 脉冲场凝胶电泳系统(美国伯乐CHEFMAPPER-XA)、凝胶成像系统(美国伯乐GelDocXR+)、培养箱(中国海河HHB11-22)、PCR仪(美国伯乐S1000)、全自动微生物生化鉴定仪和比浊仪(法国梅里埃VITEK2)。仪器均通过计量检定或校准。

3%氯化钠碱性蛋白胨水-3%APW(北京陆桥批号20210326)、3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂(北京陆桥批号20210428)、弧菌显色培养基(法国科马嘉批号20201228)、弧菌血清(SSI 批号20200113)、NotI酶(Promega 批号20200806)、金胶(Promega 批号20201209)Q、REP-PCR和ERIC-PCR引物(沈阳汇佰公司合成)。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离鉴定 按照GB 4789.7—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》[8]中方法进行菌的分离鉴定。样品经过3% APW选择性增菌后,划线接种于弧菌显色平板,挑取疑似单菌落37 ℃纯培养后,经过VITEK2系统进行生化鉴定。VP分离株保存于-80 ℃冰箱中备用。44株分离菌株全部由省疾控中心用全自动微生物生化鉴定仪鉴定为VP。

1.3.2 血清分型 按照《GB4789.7-2013食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》[8]中玻片凝集法对VP分离株进行血清分型。

1.3.3 PFGE分型及聚类分析 按照国家食品安全风险评估中心下发的《2020年食源性疾病监测工作手册》[9]操作。细菌悬液浓度4.5麦氏单位;Not I限制性内切酶40 U/胶块;37 ℃酶切4 h;电泳19 h;胶块GelRed染色30 min。应用BioNumerics7.6软件对PFGE图谱分析校准、聚类分析(非加权配对算术平均法,UPGMA)及同源性研究。

1.3.4 REP-PCR和ERIC-PCR分型及聚类分析 按文献[10-11]方法利用REP和ERIC设计引物并按照其反应体系进行PCR实验,扩增出不同DNA片段图谱,引物序列见表1。应用SPSS 13.0软件对图谱聚类分析,用系统聚类分析法中的组内聚类法,对各菌株进行聚类分析,这种方法曾被Martin-Kearley等人描述过[10],最终使用Hunter和Gaston的方法计算出各种分型方法的区分能力即分辨力(DI)[11]。

表1 REP-PCR和ERIC-PCR引物序列

上述公式中,DI是分辨力,s是型别数,nj是j型菌株数,N是菌株总数。

2 结 果

2.1 血清分型结果 44株VP,其中有8株不能进行K分型,不可分型率为18.2%。其他菌株共分为15个血清型。食源性疾病22株分离株,主要血清群为O3,其次为O1,且分为4个血清型,O3∶K6(12)O1∶K5(6),O4∶K8(2)O3∶K29(2)。食品分离株22株,主要的血清群为O2,其次为O1和O3群。其中8株为O2群但不可进行K抗原分型,其他14株可分为11个血清型, O2∶K28(3),O2∶K3(1),O1∶K32(1),O1∶K19(1),O1∶K33(1),O4∶K42(1),O4∶K34(1),O3∶K45(2),O3∶K6(1),O5∶K17(1),O10∶K24(1)。44株VP血清型结果具体见表2。

表2 44株VP血清分型结果

2.2 PFGE聚类分析结果 PFGE的分辨力(DI)达到0.986。按相似度>85%,44株VP分离株可分成3组优势带型,主要分子型为A-C组。A组共16株全部来源于临床分离株:202009(大连)、202010(大连)、202007(大连)、202011(大连)、202012(大连)、202015(沈阳)、202016(沈阳)、202017(沈阳)、202020(大连)、202001(沈阳)、202022(大连)、202014(盘锦)、202019(大连)、202013(大连)、202003(沈阳)。B组共4株全部来源于临床分离株:202006(沈阳)、202008(大连)、202021(大连)、202002(沈阳)。C组共2株全部来源于鞍山市食品分离株:202036、202039。临床分离株血清分型和PFGE分型结果一致。临床分离株间相似度>85%,相似度高。食品分离株除个别株与临床分离株相似度>95%,相似度高,其他食品分离株与临床分离株间相似度均<85%,相似度低,食品分离株血清分型和PFGE分型结果一致。食品分离株间相似度<85%,相似度低。一些可生食的即食食品分离株与临床分离株间相似度>95%,相似度高。主要分子型与血清占比分析情况见表3。表3可以看出,A组、B组和C组每组里均由血清群O3和O1菌株组成,O3和O1菌株相似度>85%,相似度高。

表3 VP主要分子型与血清群占比分析

2.4 REP-PCR和ERIC-PCR聚类分析结果 REP-PCR的分辨力(DI)达到0.947,ERIC-PCR的分辨力(DI)为0.935。REP-PCR按∑2 <5可以把44株菌分成4组优势带型A-D组,ERIC-PCR按∑2 <5可以把44株菌分成4组优势带型A-D组。PFGE聚类分析中分型的A-C组菌株,每组菌株均在REP-PCR和ERIC-PCR聚类分析中按∑2 <5而被分成相同的组,REP-PCR、ERIC-PCR分型结果和PFGE分型结果一致,但PFGE可以把REP-PCR和ERIC-PCR分型结果相同的菌株进一步分成不同亚型,例如菌株(9、10、7、11、12、15、16、17、20、1、22、14、19、13、3)(6、8、2、21),(34、35),(36、39)。

3 讨 论

血清分型结果显示,血清鉴定过程中,部分菌株不能分型,且部分菌株还需高压处理后再次做凝集实验,提示VP抗原不稳定易变异,现阶段不能做到所有菌株都被分型,且VP血清型鉴定繁琐复杂。22株食品分离株中8株不能分型,提示食品分离株较临床分离株血清型更难区分[12-14]。临床分离株血清分型较少,食品分离株血清分型较多。

辽宁省2020年VP分离株的流行血清型与辽宁省近5年VP分离株的流行血清型一致,临床VP分离株流行血清型仍为O3∶K6,食品VP分离株流行血清群仍为O2[4,15-17]。

聚类分析结果显示,临床分离株亲缘关系近,关联性强,提示临床分离株可能起源于相同的致病菌。食品分离株亲缘关系远,关联性弱,提示食品分离株可能起源于不同菌株。个别食品分离株与临床分离株亲缘关系近,关联性强,提示个别食品分离株可能起源于相同致病菌。绝大多数食品分离株与临床分离株亲缘关系远,关联性弱,提示绝大多数食品分离株可能不致病。一些可生食的即食食品分离株与临床分离株亲缘关系较近,关联性强,提示可生食的即食海产品比烹饪后的海产品可能更易致病。

食品分离株沈阳市202005与大连市202018与临床分离株在3种分型方法中相似度均较高,提示该食品分离株具有引起食源性疾病的风险,应给予关注。食品分离株202018来源是即食食品三文鱼,且图1显示,即食食品血清型主要为O2和O1,由于即食食品的直接入口的特殊性,这株菌及血清型O2和O1均应重点关注。文献显示,80年代,我国临床VP分离株血清型主要以O1、O4群为主[18-21]。近5年来,辽宁省和国外一些国家及国内其他一些省份流行血清型以O3、O1群为主[22],提示VP分离株流行血清型由O4群逐渐转变为O3群。表3可以看出,O3和O1菌株相似度>85%,相似度高,亲缘关系近,O3群和O1群菌株密切相关,因此推断血清型O3群菌株很可能来源于O1群菌株。

神奈川现象是副溶血弧菌在我萋氏培养基上的溶血现象[3],此阳性反应是由耐热直接溶血毒素(TDH)所造成的,日本学者认为神奈川现象和肠道致病性密切相关[3]。本研究发现,22株临床分离株REP-PCR指纹图谱都有600 bp这条带,而ERIC-PCR指纹图谱中都有1 000 bp这条带,值得注意的是,这22株全部都是致病菌,通过鉴定它们都产生神奈川现象。600 bp、1 000 bp两条共有扩增带与毒力基因及其致病性的相关性有待进一步探讨。

评价分型方法因素[2]:1) 分型力。即种内的细菌都能通过某种方法的使用得到分型的能力。2) 鉴别力(DI)。对两个不相关菌株被区分为不同型的可能性进行定量。3) 可重复性。是指使用某一种方法对某一特定菌株重复测试时能产生相同结果的能力。4) 结果是否易于解释。电泳带型是否易于解释成为评定一种分型方法实用性的一个因素。5) 同时还应考虑该技术是否经济、操作是否简便以及是否能快速地获得结果等。

PFGE、REP-PCR和ERIC-PCR方法对辽宁省VP分离株分型均是可行的,这3种分子分型方法满足上述5种评价标准。PFGE、REP-PCR和ERIC-PCR 3种方法扩增均基本稳定,每次试验均能重复产生一定复杂程度的比较清晰且有不同程度多态性DNA主条带。PFGE分型方法的分辨力更优于REP-PCR和ERIC-PCR分型方法,REP-PCR分辨力要优于ERIC-PCR。REP和ERIC重复基因序列在2020年辽宁省副溶血性弧菌分离株中普遍存在,此外,REP-PCR和ERIC-PCR方法操作简便和快捷,所需的费用低时间短,但分型的分辨力却很高,再现性好,因此利用REP-PCR和ERIC-PCR方法对副溶血性弧菌菌株分型具有可行性。大量的研究表明,虽然有时REP-PCR和ERIC-PCR分辨力和再现性比PFGE方法稍低,但与PFGE获得的结果确有很好的关联度。与PFGE方法相比,REP-PCR、ERIC-PCR分型操作简单快捷,所需的费用非常低、不需要昂贵的专业仪器设备和分析软件,实验周期短,现阶段辽宁省市、区(县)级疾控实验室普遍缺乏实验经费和PFGE专业设备、软件的情况下,可应用REP-PCR和ERIC-PCR方法对YE进行食源性疾病及食物中毒暴发流行的溯源研究。

综上,3种方法分型结果一致,对于评估辽宁省副溶血性弧菌流行趋势及分布规律是可行的,在副溶血性弧菌所引起食源性疾病暴发流行时,有条件的实验室可以应用这3种方法对致病菌进行快速有效溯源。

利益冲突：无