水飞蓟宾靶向结直肠癌肿瘤微环境作用机制研究进展

何盛澜，徐小雯，龚 彪，3

1.上海中医药大学附属曙光医院消化病研究所（上海 201203）；2.上海中医药大学附属曙光医院内镜中心（上海 201203）；3.上海中医药大学附属曙光医院消化内科（上海 201203）

结直肠癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率在全球范围内位于恶性肿瘤的第3位，病死率位于第2 位，我国结直肠癌的发病率也呈逐年上升的趋势，给医疗卫生系统带来了沉重负担［1-2］。目前，结直肠癌的常规治疗方式包括根治性外科手术、免疫治疗、靶向治疗及新辅助放射治疗（以下简称“放疗”）、化学疗法（以下简称“化疗”）等。研究［3］表明，肿瘤的侵袭、转移及耐药与肿瘤细胞的自发性遗传学异常有关，并在很大程度上受肿瘤微环境调控。肿瘤细胞能够通过调控细胞因子的生成与分泌重塑肿瘤微环境，继而为自身增殖、侵袭创造更有利的条件，这一过程是肿瘤发生发展的关键环节［4-7］。

近年来，虽然靶向药物的研发与临床转化明显提升了进展期结直肠癌患者的生存率［8］，但由于个体化的差异，仍有部分患者无法从中获益［9-10］。天然产物具有高活性、多靶点、毒副作用小等特点，是靶向药物的重要来源。作为天然产物的一种，水飞蓟宾能够在肿瘤的不同阶段发挥抗肿瘤作用，如诱导细胞凋亡和自噬、抑制血管新生及迁移，且安全性较高，可作为日常膳食补充剂，在结直肠癌的研究中引起了广泛关注［11-12］。本文主要从血管生成、炎症反应、免疫细胞、细胞外基质以及肿瘤相关成纤维细胞等方面综述水飞蓟宾对结直肠癌肿瘤微环境的靶向作用，以期为结直肠癌的治疗提供参考。

1 肿瘤微环境

肿瘤微环境是指围绕在肿瘤细胞周围的细胞和理化成分，其在肿瘤形成和进展的各个时期呈动态变化，并对肿瘤生长、血管形成、上皮细胞-间充质转化等过程起至关重要的作用［13］。肿瘤微环境不仅是肿瘤细胞转化生长过程中的一种被动反应结果，也是肿瘤进展中的主动参与者，更是肿瘤发展各个阶段不可或缺的固有组成部分。

与肿瘤细胞相比，肿瘤微环境中的非肿瘤成分具有更好的遗传稳定性，不易产生获得耐药基因突变并参与调控药物耐受的可逆机制［14］，因此以肿瘤微环境作为药物靶点，发生耐药的概率相对较低。研究［15］表明，肿瘤微环境正常化能够减弱获得性耐药、抑制肿瘤进展、延长患者生命周期。目前肿瘤微环境靶向药物已经被证实对多种类型的肿瘤有效，与放疗、化疗联用，可以增强抗肿瘤治疗效果［16］。此外，不同类型肿瘤的肿瘤微环境变化具有一定的共通性，这也为治疗药物的普适性带来了希望。

2 水飞蓟宾靶向结直肠癌肿瘤微环境的作用机制

水飞蓟是一种菊科植物，其果入药，在肝脏疾病的治疗中已有非常悠久的历史。水飞蓟素是从该植物的种皮中提取的一类有效成分，其中以水飞蓟宾含量最高、作用最强。研究［12，17-18］显示，水飞蓟宾具有较强的抗肿瘤作用，其对肿瘤细胞的调控机制涉及阻滞细胞周期、诱发细胞凋亡、调控自噬和调节微小RNA 等，上述药理特性均已在结直肠癌体内、体外实验中得到了广泛验证［19］。除了对肿瘤细胞的抑制作用以外，水飞蓟宾对肿瘤微环境中的各种成分亦具有靶向抑制性。

2.1 抑制血管生成 实体肿瘤的新生血管由内皮细胞和周皮细胞构成，是肿瘤微环境中最重要的成分，也是实体肿瘤从癌前病变发展为恶性侵袭表型过程中至关重要的一步［20］。当肿瘤大小超过1 mm3时，氧气和营养物质很难输送至肿瘤核心细胞中，进而造成细胞缺氧。缺氧环境会导致肿瘤细胞分泌多种促血管生成因子［如血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）］，并从邻近血管中招募内皮细胞［21］；肿瘤微环境中的其他成分（如肿瘤相关成纤维细胞、免疫细胞）也可能通过细胞外基质重塑和分泌促血管生成因子，并由此促进血管形成［20］。研究［12］证实，水飞蓟宾能够在肿瘤治疗中发挥显著的抑制血管生成作用，其中也包括结直肠癌。

Sameri 等［11］研究表明，水飞蓟宾可以抑制血管生成，进而发挥抗肿瘤作用，经水飞蓟宾干预的结直肠癌CT26细胞中，涉及血管生成的VEGF、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、环氧合酶-2（COX-2）、血管生成素（Ang）-2 和Ang-4mRNA 水平显著降低。Singh 等［22］采用皮下注射结肠癌HT29 细胞的方法建立裸鼠移植瘤模型，并用水飞蓟宾进行干预，结果显示水飞蓟宾可以降低移植瘤中血管生成相关蛋白诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、COX-2、HIF-1α、VEGF 的表达。Ravichandran 等［23］以氧化偶氮甲烷（AOM）诱导的结肠癌A/J小鼠为研究对象，发现水飞蓟宾可以显著抑制小鼠肿瘤组织中VEGF 和iNOS 的表达，进而发挥抗血管生成的作用。Rajamanickam 等［24］采用APC-min/+小鼠建立自发肠道腺瘤动物模型，并在此基础上探讨水飞蓟宾对结直肠癌的化学预防作用，结果显示水飞蓟宾能够选择性抑制模型小鼠息肉中巢蛋白阳性微血管的形成，进而减少息肉形成。

2.2 抑制炎症反应 肿瘤细胞分泌的炎症因子会募集免疫细胞迁移至肿瘤微环境，这些免疫细胞容易发生失常反应，从而有利于肿瘤细胞的生长，持续的内环境紊乱又会加重机体炎症反应［25］。炎症环境是结直肠癌形成和发展的重要调节因素，异常表达的趋化因子和细胞因子介导的串扰既驱动着肿瘤的转移、耐药和免疫抑制，又是抗肿瘤治疗药物的潜在靶点［26］。慢性炎症通过氧化应激、异常的免疫介导等途径促进肿瘤发展，常见的影响因子有信号转导和转录激活因子3（STAT3）、核因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-1β、IL-6等［27-28］。

Raina等［29］研究证实，水飞蓟宾能够明显抑制TNF-α诱导的NF-κB 活化及炎症因子COX-2 和iNOS 的表达，从而起到抗炎、抗肿瘤作用。除此之外，结直肠癌异种移植模型、化学肿瘤模型以及基因工程小鼠结直肠癌模型均证实水飞蓟宾对iNOS 具有抑制作用［22-24］。Kauntz 等［30］采用水飞蓟宾干预AOM 诱导的结直肠癌模型大鼠，结果显示，与对照组相比，水飞蓟宾能明显降低模型大鼠结肠黏膜中IL-1β、TNF-α的表达水平，表现出强大的促凋亡、抗炎作用。

水飞蓟宾能够抑制三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的结肠炎模型大鼠结肠组织中NF-κB激活及IL-1β、TNF-α表达，联合熊去氧胆酸（UDCA）还能显著改善模型大鼠肠道的抗氧化能力，进而缓解炎症［31］。与芦丁联用时，水飞蓟宾能显著抑制结肠癌HT-29 细胞中炎症标志蛋白［NF-κB、人核因子κB抑制蛋白-α（IKK-α）、人核因子κB 抑制蛋白-β（IKK-β）］表达，下调B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、中期因子-2（MK-2）mRNA 的表达，从而诱导细胞凋亡［32］。

可见，水飞蓟宾能够有效抑制炎症因子的表达，下调炎症相关通路，从而改善肿瘤微环境的慢性炎症状态。

2.3 调节免疫细胞 免疫细胞主要分为适应性免疫细胞和先天免疫细胞，是肿瘤微环境的重要组成部分。免疫细胞具有双重调节功能，一方面其可以调节免疫功能，从而抑制肿瘤的生成；另一方面，免疫细胞的促炎和免疫抑制作用又参与肿瘤微环境的重塑，这一过程会增加肿瘤微环境的复杂性，从而有利于肿瘤细胞的免疫逃逸［28］。免疫细胞与趋化因子、细胞因子等共同建立炎症环境，而肿瘤微环境内的细胞重塑在很大程度上是由炎症驱动的，因此深入了解其免疫发病机制有利于制定更为有效的治疗策略［33］。

肥大细胞与免疫细胞、炎症介导的结直肠癌密切相关，其能通过调节促炎细胞因子和诱导性炎症酶发挥重要作用［34-35］。Kim等［36］研究发现，浓度范围在0.05～0.4 mmol/L 的水飞蓟宾能不同程度地下调人肥大细胞HMC-1中的NF-κB信号通路，同时抑制IL-6、IL-8、TNF-α等促炎细胞因子的产生。

巨噬细胞是肿瘤微环境中较为丰富的细胞之一，其可以通过分泌细胞因子介导炎症反应，如激活IL-6R/STAT3 途径，从而增强结直肠癌细胞的增殖和侵袭能力［37-38］。水飞蓟宾能够有效抑制小鼠巨噬细胞系RAW264.7 中TNF-α、COX-2、一氧化氮（NO）和IL-6 的表达，其抗炎作用与抑制NF-κB 和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性有关［39-40］。

2.4 调节细胞外基质 细胞外基质是胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖/黏多糖和几种糖蛋白组成的非细胞三维大分子网络，基质成分之间相互连结，并与细胞黏附受体相连，在组织和器官中形成复杂网络，细胞表面受体通过细胞外基质转导信号，调节细胞生长、迁移、分化等多种功能［41］。细胞外基质是一种动态结构，在正常组织中连续不断地经历可控的重塑，而当组织病变时，细胞外基质的组成、结构、刚度均会发生变化，即重塑异常，其与肿瘤的发生发展有关［42］。水飞蓟宾能够显著削弱肿瘤细胞与细胞外基质成分的相互作用，从而减弱肿瘤细胞的动力和侵袭力，纤连蛋白在包括结直肠癌在内的多种恶性肿瘤中呈高表达，水飞蓟宾可显著降低其表达水平［12］。

肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶（MMPs）是降解细胞外基质，抑制肿瘤细胞侵袭、转移的关键因素，可作为肿瘤复发、转移的预测标志物，也是肿瘤治疗的有效靶点［43-44］，体外、体内实验已证实水飞蓟宾能够显著抑制MMPs 表达。Lin 等［45］在结直肠癌LoVo 细胞的体外实验中发现，水飞蓟宾可以降低激活蛋白-1（AP-1）的结合活性，下调MMP2 表达，进而抑制肿瘤细胞的侵袭能力。结直肠癌细胞实验和异种移植肿瘤模型研究均显示，水飞蓟宾可通过抑制NF-κB 转录活性而降低MMP9表达，从而抑制肿瘤细胞迁移［11，29］。

2.5 抑制肿瘤相关成纤维细胞激活 在肿瘤微环境中，与肿瘤发生发展有关的成纤维细胞被称为肿瘤相关成纤维细胞，主要来源于正常的成纤维细胞、上皮细胞、骨髓间充质细胞等，肿瘤细胞分泌的生长因子、细胞因子等均能激活这些细胞并将其改造为有利于自身发展的肿瘤相关成纤维细胞［46-47］。肿瘤相关成纤维细胞具有高可塑性和极端的异质性，其生物标记物较多，主要有α-平滑肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（VIM）、成纤维细胞活化蛋白（FAP）、肌间线蛋白等，其中α-SMA是肿瘤相关成纤维细胞最可靠的特异性标志物，FAP则是基于肿瘤相关成纤维细胞进行治疗的最有前途的靶点［48］，直接靶向FAP 的人源单克隆抗体西罗珠单抗（Sibrotuzumab）已经成功应用于临床［15］。

目前有关水飞蓟宾作用于肿瘤相关成纤维细胞的报道较少。水飞蓟宾能够靶向抑制转化生长因子（TGF）-β2，从而阻止前列腺癌上皮细胞介导的肿瘤相关成纤维细胞激活［49］。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是肿瘤相关成纤维细胞介导的前列腺癌侵袭的关键成分，水飞蓟宾可以抑制NF-κB和AP-1的结合活性，从而降低肿瘤相关成纤维细胞中的MCP-1 表达［50］。此外，水飞蓟宾与IPI-549 联用，可有效重塑乳腺癌模型小鼠的肿瘤微环境，抑制肿瘤相关成纤维细胞激活，同时具有抗纤维化、抑制肿瘤细胞迁移和血管生成的作用［51］。但在其他肿瘤中尚缺乏相关的研究。

研究［52］发现，通过药物阻滞或者基因敲除STAT3可以抑制TGF-β 信号通路所诱发的肌成纤维细胞激活。水飞蓟宾是已知的天然STAT3抑制剂，其对STAT3磷酸化的抑制作用在多种临床前肿瘤模型中均得到了证实［53］。因此，水飞蓟宾可能是通过STAT3信号通路抑制结直肠癌中肿瘤相关成纤维细胞激活的潜在靶点。

3 水飞蓟宾制剂的研究进展

水飞蓟宾的黄酮类结构使其生物利用率较差，为改善其吸收效果，临床一般使用水飞蓟宾磷脂复合物。但即便给予结直肠癌患者口服最大剂量的水飞蓟宾磷脂复合物，仍不能发挥其最佳药理活性［12，54］，因此研发具有更高吸收效能的水飞蓟宾制剂是十分必要的。

为了提高水飞蓟宾的生物利用度，许多研究者通过化学结构修饰开发了许多半合成衍生物和制剂。Xu等［55］发现，水飞蓟宾希夫碱衍生物较水飞蓟宾溶解度升高，能通过增强抗炎和抗凋亡作用抵消四氯化碳诱导C57BL/6J 小鼠的急性肝损伤，且安全性良好。Xi等［56］研究表明，相比水飞蓟宾，糖化基水飞蓟宾衍生物具有更好的水溶性（＞15 mg/L），该衍生物在肝微粒体中表现出良好的代谢稳定性。另外，水飞蓟宾磷酸二酯糖偶联物可大大提高水飞蓟宾中黄酮木脂素部分的水溶性和抗氧化活性［57］。

近年来纳米靶向药物得到了快速的发展，纳米药物不仅可以明显降低药物毒性，还具有改善生物利用率和增强靶向特异性等优点，可明显提高化疗的疗效和安全性［58-60］。研究［61］发现，负载水飞蓟宾的磁性尼奥小体纳米颗粒（MNNPs）复合物对结直肠癌HT-29 细胞具有明显的细胞毒性作用，可诱导HT-29 细胞发生凋亡，且呈剂量和时间依赖性。虽然纳米医学提高了水飞蓟宾的生物利用度，但其带来的副作用和并发症不容忽视，须不断进行优化，以形成肿瘤微环境靶向标准化治疗体系，进而使越来越多的肿瘤患者从中获益［62-63］。

4 总结与展望

肿瘤微环境在恶性肿瘤治疗中的重要性是毋庸置疑的，肿瘤细胞可利用血管生成增强自身的营养供给，并通过炎症反应创造有利于自身发展的免疫微环境，重塑细胞外基质，进而实现肿瘤的侵袭、转移和定植。虽然不同类型的肿瘤微环境具有一定的共通性，但个体间和不同肿瘤之间的肿瘤微环境仍存在一定差异，且肿瘤微环境具有强大的代偿调控机制，因此需挖掘更贴合临床发展的模型以探索肿瘤微环境影响肿瘤发生发展的机制，摸索肿瘤微环境中各肿瘤标记物的临界值，并设定相关标准，从而为个体化治疗及新靶点的研究提供依据。

水飞蓟宾是十分理想的结直肠癌治疗药物，其不仅对结直肠癌肿瘤细胞有明显的抑制作用，还可通过调节肿瘤微环境中各个成分的表达影响结直肠癌的形成和发展。Jain［64］于2001年首次提出“血管正常化”的概念，认为抗血管生成药物可以在破坏肿瘤血管之前使其正常化，进而改善药物输送和增加组织含氧量。还有研究［65］认为抗血管生成药物具有“时间窗”，有利于增加其他药物作用于肿瘤细胞的疗效。因此，只有合理使用抗血管生成药物、抓住“血管正常化时间窗”，才能使联合用药发挥最佳的协同作用；但目前对于血管正常化期间肿瘤是否进展仍存在争议，所以血管正常化过程中的细胞分子机制也需进一步验证。在轻度缺氧状态下，抗血管生成是否是抗肿瘤的关键机制，还需进一步从“血管正常化”和“时间窗”的角度进行研究。由于目前相关研究较少，因此水飞蓟宾是否能够通过血管正常化而抑制肿瘤进展仍待探索。