茯苓皮总三萜大孔树脂纯化工艺及体外抗炎活性研究

吕婷婷,王妍妍,2,张 越,2,孟祥宇,丁卫健,彭代银,2,王 雷,2,姚 亮,2,陈卫东,2,3

(1.安徽中医药大学药学院,安徽 合肥 230012;2.省部共建安徽道地中药材品质提升协同创新中心,安徽 合肥 230012;3.中药饮片制造新技术安徽省重点实验室,安徽 亳州 233500)

炎症是炎症因子共同作用的结果,当机体受到刺激因子侵袭时,免疫系统会发生一系列反应,产生血管充血扩张、毛细血管通透性增加的反应,以稀释炎症部位刺激因子水平,并伴随红、肿、热、痛等不适症状[1-2]。现阶段,非甾体抗炎药多应用于炎症性疾病,但同时也伴有不良反应,不利于疾病的有效治疗[3-4]。许多天然药物具有较好的抗炎作用[5-8],且作用温和,毒性小,无不良反应[8]。因此,研究天然药物中发挥抗炎作用的主要成分尤为重要。

茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf为多孔菌科真菌的干燥菌核[9],其主要活性成分为茯苓多糖和三萜。茯苓皮为加工茯苓片、茯苓块时削下的褐色茯苓表皮。茯苓皮中主要活性成分是三萜类成分,其中三萜类物质含量高于茯苓其他部位[10],具有利尿[11]、降血糖[12]、抗肿瘤[13]等药理作用。课题组前期研究[14]发现,茯苓总三萜具有良好的抗炎作用,但茯苓皮中三萜成分的抗炎作用、三萜类化合物是否为治疗炎症的主要成分尚不明确。

茯苓皮三萜多见于粗提、萃取或分离单体成分的研究[15],存在富集三萜含量较少、制备工艺复杂等问题。因此,本研究以总三萜含量为指标,采用四因素三水平正交试验优化HPD-100型大孔树脂纯化茯苓皮总三萜的工艺,并观察茯苓皮总三萜纯化前后对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW 264.7细胞炎症模型的抗炎作用。

1 材料

1.1 材料与试剂 茯苓皮由安徽省亳州市众益堂中药材销售有限公司提供,经安徽中医药大学俞年军教授鉴定为茯苓Poriacocos(Schw. )Wolf的外皮;香草醛(批号 210524Q)、冰醋酸(批号 20180810JN)、高氯酸(批号 20210613):上海润捷化学试剂有限公司;水为超纯水,其他试剂均为分析纯;HPD-100型大孔吸附树脂(批号 400-910-1997):金克隆(北京)生物技术有限公司;LPS(批号 S11060)、齐墩果酸(批号 B20954,含量≥98%):上海源叶生物科技有限公司;吲哚美辛肠溶片(批号 Y18M10C83262):山西省临汾宝珠制药有限公司;DMEM培养基(批号 ATBRC):山东思科捷生物技术有限公司;细胞计数试剂盒-8(cell count kit-8,CCK-8;批号 22082317):广州赛国生物科技有限公司;胎牛血清(fetal bovine saline,FBS;批号 2177370):赛默飞生物制药有限公司;一氧化氮(nitric oxide,NO)试剂盒(批号 A013-2-1):南京建成生物工程研究所;白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)试剂盒(批号 JL21070009)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)试剂盒(批号 JL21070002)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)试剂盒(批号 JL21060011):武汉基因美科技有限公司。

1.2 仪器 紫外可见光光度计(型号 UV-1900):上海元析仪器有限公司;低温冷却液循环泵(型号 DLSB-10/20):郑州长城科工贸有限公司;智能恒流泵(型号 BT1-200V-LCD):上海琪特分析仪器有限公司;循环水式多用真空泵[型号 SHZ-D(Ⅲ)]:郑州市仪特仪器有限公司;集热式恒温加热磁力搅拌器(型号 DF-101S):巩义市予华仪器有限公司;酶标分析仪(型号 Rayto RT-6100):美国赛默飞世尔科技有限公司;CelMate二氧化碳培养箱(型号 CLM-170B-8-NF):益世科(上海)企业发展有限公司;立式压力蒸汽灭菌器(型号 YXQ-LS-100SII):上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

2 方法

2.1 茯苓皮总三萜提取工艺 按照文献[16]的方法制备茯苓总三萜。称取过40目筛的茯苓皮粉末50 g,置于圆底烧瓶中,加入1 L甲醇,于70 ℃水浴中回流6 h,提取2次,合并滤液,抽滤,60 ℃旋蒸至50～70 mL,转移至蒸发皿中,于55 ℃烘箱烘干,得到粗提产物。粗提产物经乙酸乙酯萃取后得到乙酸乙酯部分。取适量茯苓皮总三萜粉末,甲醇复溶,配制成一定浓度的样品溶液。

2.2 香草醛—高氯酸法测定总三萜含量

2.2.1 标准品溶液的制备 避光下精密称取适量齐墩果酸粉末,甲醇溶解,得到0.1 mg/mL齐墩果酸对照品溶液。

2.2.2 检测波长的选择 取适量齐墩果酸标准品溶液,水浴挥干,加5%香草醛—冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸1.0 mL,60 ℃水浴15 min,冷却后加入冰醋酸5.0 mL,混匀,于450～800 nm范围内进行扫描,选择有最大紫外吸收的波长为检测波长。

2.2.3 标准曲线的制备及方法学考察 分别取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL的0.1 mg/mL齐墩果酸对照品溶液于试管中,按“2.2.2”项下显色方法,在最大吸收波长下测定吸光度(optical density,OD)值,分析计算得回归方程。经方法学考察仪器精密度、方法准确度、加样回收率和样品稳定性。

2.2.4 总三萜含量的测定 取茯苓皮总三萜粗提样品溶液,采用“2.2.2”项下显色方法,于最大吸收波长测定吸光度,代入标准曲线中计算三萜的百分含量。

2.3 茯苓皮总三萜纯化样品的制备 选用HPD-100型大孔树脂,用无水乙醇浸泡24 h。湿法装柱后用95%乙醇洗涤树脂,洗涤至层析柱流出液加水[V(流出液):V(水)=1∶5]时没有白色浑浊,再用蒸馏水洗至流出液澄清且无醇味,树脂层面上保持2～5 mm液体,以免干柱,备用。称取经过预处理好的HPD-100型大孔吸附树脂,湿法装柱,将120 mL茯苓皮总三萜粗提样品溶液通过盛有大孔吸附树脂的色谱柱,控制流速为1 mL/min。35%乙醇洗脱杂质,95%乙醇洗脱三萜类物质,收集洗脱液,于50 ℃烘箱烘干,即得茯苓皮总三萜纯化样品。

2.4 单因素与正交试验设计 根据文献[17]的纯化工艺,以产物中总三萜含量为指标,采用“2.3”项下方法,考察上柱的大孔树脂质量、上样浓度、洗脱杂质容积、洗脱总三萜容积对纯化效果的影响,每个因素下不同水平实验重复3次。

根据正交试验原理设计4因素3水平[L9(34)]实验组合,见表1。根据纯化产物的总三萜含量进行正交分析,确定纯化茯苓皮总三萜的工艺。

表1 L9(34)正交试验的因素水平表

2.5 纯化工艺的重复性验证 为验证该纯化工艺的稳定性,本研究重复5次平行纯化茯苓皮总三萜,以考察本次工艺的重复性,确保每次纯化所得茯苓皮总三萜纯化产物的总三萜含量稳定。

2.6 富集总三萜方法比较 为比较醇提法、萃取法、大孔树脂吸附方法对富集茯苓皮总三萜的影响,本研究采用醇提法获取茯苓皮总三萜醇提物粉末、乙酸乙酯萃取获取茯苓皮总三萜乙酸乙酯部分、经大孔树脂纯化工艺获取总三萜纯化产物粉末,采用香草醛—高氯酸法对其进行总三萜含量测定,以初步对比以上方法富集茯苓皮总三萜的效果。

2.7 体外抗炎活性的验证

2.7.1 细胞培养及分组 将RAW 264.7细胞培养于DMEM培养基(含10% FBS及1%青霉素—链霉素混合液)中,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。每日观察细胞状态,密度达80%～90%后传代,用于后续实验。将培养后的细胞分为空白组、模型组(LPS组)、阳性对照(吲哚美辛)组、茯苓皮总三萜粗提组、茯苓皮总三萜纯化组。

2.7.2 CCK-8法测定药物对细胞存活率的影响 取对数生长期的RAW 264.7细胞,用空白培养基稀释混匀,制成细胞悬液,在37 ℃、5% CO2条件下孵育,至细胞贴壁生长至96孔板的80%左右时,吸弃上清,每孔加入药液100 μL,孵育24 h后弃去药液,避光环境下根据公式[V(空白培养基)∶V(CCK-8)=1∶10]配置CCK-8反应液,将其加入96孔板,置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育30 min,于酶标仪450 nm波长下检测OD值。细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

2.7.3 建立炎症细胞模型与给药 取对数期细胞,用空白培养基稀释细胞,得细胞悬液,在37 ℃、5% CO2条件下孵育,细胞贴壁生长至96孔板的80%左右时,吸弃上清,每孔加入药液100 μL,孵育24 h后弃去药液,再加入1 μg/mL的LPS 100 μL于96孔板中,放置在37 ℃、5% CO2培养箱刺激12 h,以复制炎症细胞模型。

2.7.4 NO释放量与细胞炎症递质水平的测定 根据“3.3”项下操作方法,收集不同组分上清,按照NO、IL-1β、IL-6、TNF-α试剂盒说明书操作,测定NO释放量和细胞炎症递质IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

3 结果

3.1 总三萜的含量测定与方法学考察 本实验采用香草醛—冰醋酸法测定产物的总三萜含量,该法被广泛用于测定化合物中总三萜含量[18-20]。经显色后扫描的最大OD值对应波长为546 nm(见图1),齐墩果酸的标准曲线为y=11.18x-0.136 7(r=0.999 6),线性范围为0.3～0.8 mg/mL。根据方法学考察结果,该法精密度良好,重复性高,且于反应后90 min内稳定可行,平均加标回收率为99.13%,以上结果均提示该法满足样品的分析要求。

图1 齐墩果酸的检测波长和OD值关系

3.2 单因素实验

3.2.1 上柱大孔树脂质量对纯化总三萜的影响 大孔吸附树脂具有三维空间网状结构,具备选择性好、吸附效果良好且解吸附简单、价格便宜等诸多优点[21]。如图2所示,上柱大孔树脂质量增加,纯化后三萜的百分含量呈上升趋势,因上柱25 g上柱大孔树脂达上柱极限,故将上柱大孔树脂质量考察上限定于25 g,且25 g大孔树脂与20 g大孔树脂纯化后所得产物总三萜含量相近,故20 g大孔树脂符合资源的合理应用。

图2 上柱大孔树脂质量、上样浓度、洗脱杂质容积、洗脱三萜容积对纯化茯苓皮总三萜的影响

3.2.2 上样浓度对纯化总三萜的影响 上样浓度增加时,供试液在15 mg/mL浓度时纯化效果最佳,浓度过高可能导致树脂吸附三萜成分呈过饱和状态,吸附不充分进而导致纯化后三萜含量下降,不利于样品的有效利用。见图2。

3.2.3 洗脱杂质容积对纯化总三萜的影响 洗脱杂质容积增大,得到的纯化物总三萜含量增加,尤其是洗脱杂质容积为0～5 BV时。但过度洗脱杂质可能会导致部分三萜损失,进而导致纯化产物总三萜含量下降。见图2。

3.2.4 洗脱三萜容积对纯化总三萜的影响 随着洗脱三萜容积的增加,纯化物总三萜含量呈上升趋势。但过度洗脱可能会导致部分未完全洗去的杂质流出,从而影响纯化效果。见图2。

3.3 正交试验 茯苓皮总三萜纯化效果的影响因素按影响程度(全距)大小依次是洗脱杂质容积、上样浓度、洗脱三萜容积、上柱大孔树脂质量。改进后茯苓皮总三萜纯化工艺为上柱大孔树脂质量20 g,上样浓度15 mg/mL,35%乙醇洗脱杂质容积5 BV,95%乙醇洗脱三萜容积4 BV,所得纯化物总三萜含量为70.36%。见表2、表3、表4。

表2 L9(34)正交试验原始数据

表3 正交试验结果的描述性统计

表4 正交试验方差分析结果

3.4 重复性验证 经重复该工艺纯化得到5份不同批次的茯苓皮总三萜纯化产物,经“2.2.2”项下显色方法测定纯化后总三萜含量,分别为70.36%、71.39%、67.83%、69.07%、66.19%,RSD为2.97%,提示该法重复性较好,纯化产物总三萜含量稳定。

3.5 富集总三萜方法比较 经对醇提法、萃取法、大孔树脂吸附法获取的茯苓皮总三萜进行含量测定,其含量分别为29.97%、45.84%、70.36%,提示萃取法在一定程度上可富集茯苓皮中的总三萜成分,其中大孔树脂吸附法富集总三萜成分最佳。

3.6 体外抗炎活性验证实验

3.6.1 茯苓皮总三萜对细胞存活率的影响 CCK-8检测结果如图3所示,各分组的细胞活力与空白组比较,差异均无统计学意义(P>0.05),提示各分组浓度均无明显的细胞毒性,故分组给药浓度为50、150、250 μg/mL。

图3 茯苓皮总三萜对RAW 264.7细胞存活率的影响

3.6.2 茯苓皮总三萜对细胞NO释放量的影响 与空白组比较,模型组RAW 264.7细胞中NO浓度显著增加(P<0.05)。与模型组比较,各给药组RAW 264.7细胞中NO浓度均显著降低(P<0.05)或呈降低趋势(P>0.05),其中茯苓皮总三萜纯化组降低NO水平的效应呈现剂量依赖性。见图4。

注:与空白组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05

3.6.3 茯苓皮总三萜对RAW 264.7细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响 与空白组比较,模型组RAW 264.7细胞内TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著增加(P<0.05);与模型组比较,各给药组RAW 264.7细胞内TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.05)。见图5。

注:与空白组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05

4 讨论

萜类物质为许多中药的主要活性成分,但存在提取含量低、种类复杂、不易分离等问题。本研究对醇提法、有机溶剂萃取法、大孔树脂纯化法提取茯苓皮中萜类物质进行了初步对比。结果表明,醇提法获得总三萜成分的百分含量为29.97%,经有机溶剂乙酸乙酯萃取后其总三萜百分含量富集至45.84%,经大孔树脂纯化后总三萜含量可达70.36%。由此可见,大孔树脂纯化茯苓皮总三萜是一个切实可行的方法。

本研究以富含该成分较多的茯苓皮为研究对象进行提取纯化,建立一种HPD-100型大孔树脂纯化茯苓皮总三萜的工艺,并通过体外实验对比其纯化前后的抗炎活性。在单因素实验基础上,即上样树脂质量、上柱大孔浓度、洗脱杂质容积、洗脱三萜容积均对纯化茯苓皮总三萜的含量有一定影响,以纯化后总三萜含量为指标,建立4因素3水平正交表,经正交实验获取纯化茯苓皮总三萜的最佳纯化条件。根据文献[17],改进后的纯化工艺为上柱树脂质量20 g,上样浓度15 mg/mL,35%乙醇洗脱杂质容积5 BV,95%乙醇洗脱三萜容积4 BV,茯苓皮总三萜纯化效果影响因素按影响程度大小排序依次是洗脱杂质容积、上样浓度、洗脱三萜容积、上柱大孔树脂质量,得到化合物总三萜含量为70.36%,较粗提制备的三萜含量提高40%,并且经重复性实验验证该工艺纯化总三萜含量较稳定。

LPS诱导的RAW 264.7细胞急性炎症模型具有操作简易、模型稳定、快速经济等特点[22]。炎症递质NO参与炎症反应,调节NO水平可能是发挥抗炎作用的重要途径[23-26]。Bao等[27]依据三萜单体化合物抑制NO含量水平,筛选出发挥较好抗炎作用的单体成分,并依据其母核、官能团结构的差异,探讨其发挥抗炎效果的构效关系。此外,也有许多研究[2,23,28]报道,以调节NO释放量为参考,考察天然药物的抗炎作用。

炎症反应发生时,炎症细胞可释放出致炎因子,其生物标志物为IL-1β、IL-6和TNF-α等[29-31],是研究药物抗炎作用的常用指标[23]。本研究通过建立细胞炎症模型,测定细胞释放的NO含量与炎症因子水平,观察粗提与纯化的茯苓皮三萜抗炎作用。结果表明,粗提与纯化的茯苓皮三萜能有效降低RAW 264.7细胞内NO含量与炎症因子水平,纯化后产物的抑制作用更明显,这提示茯苓皮总三萜是发挥抗炎作用的主要药效成分。