基于PI3K/Akt 信号通路的骨松益骨方对去势大鼠的骨保护作用

郑旭霞，柴爽，魏立伟，秦娜［河南省洛阳正骨医院（河南省骨科医院），河南郑州 450016］

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一种骨骼脆性增加并伴随着低骨密度和微架构恶化的疾病，其因雌激素缺乏使骨小梁结构受损、骨皮质变薄，即使患者在非创伤或轻微创伤性时，受损的骨骼也会骨折[1]。骨质疏松性骨折的致残率及致死率均较高，随着人口老龄化，绝经后骨质疏松症已成为一个全球性问题。如今，临床上应用的治疗药物大多是化学合成药物，有一定的副作用，利用传统中药或其制剂治疗绝经后骨质疏松症已成为新的研究热点[2]。

依据中医药理论，在长期临床实践中河南省洛阳正骨医院（河南省骨科医院）自拟了骨松益骨方，该方由黄芪、党参、当归、淫羊藿、杜仲、延胡索、制没药、鸡血藤配伍组成，适用于脾肾气虚血瘀、原发性绝经后骨质疏松症。临床研究[3-4]证实，骨松益骨方可促进骨形成，提高患者骨密度，有效改善患者肾虚血瘀症状及原发性绝经后骨质疏松症的临床症状，较好地缓解了患者骨质疏松性骨痛症状，降低了脆性骨折发生率且不良反应小。

网络药理学，依据系统生物学理论通过搭建“多成分-多靶点-多途径”的网络平台，可探寻药物-疾病的关联性[5-6]，这恰恰与中药的多组分、多归经、多靶点、多功效等特点相符，符合中医理论的“整体思想”。本研究拟基于网络药理学方法，建立多层网络，并借助去卵巢动物模型，验证骨松益骨方的作用及对PI3K/Akt 信号通路的影响，从多角度阐释骨松益骨方防治绝经后骨质疏松症的分子机制，为后续的药效研究及预测作用机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 筛选骨松益骨方活性成分及相关靶基因在中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http//tcmspw.com/tcmsp.php）中筛选骨松益骨方中的8 味中药黄芪、党参、当归、淫羊藿、杜仲、延胡索、制没药、鸡血藤的活性成分，条件设定为：口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30% 、药物相似性（Drug-Likeness，DL）≥0.18，再将活性成分对应的靶基因输入蛋白质数据库UniProt（https：//www.uniprot.org/）将其转换成对应的基因名称。

1.2 获取绝经后骨质疏松症疾病相关基因及药物潜在作用靶点利用GeneCards（https：//www.Genecards.org）、TTD（https：//db.idrblab.org/ttd/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）、OMIM（https：//omim.org/）检索并筛选绝经后骨质疏松症疾病相关基因。利用R语言将骨松益骨方靶点和疾病靶点取交集，绘制韦恩图，获得骨松益骨方活性成分治疗绝经后骨质疏松症的潜在作用靶点。

1.3 构建“药物活性成分-作用靶点”关系网络利用Cytoscape软件构建“药物活性成分-作用靶点”调控网络。中药活性成分及作用靶点以“节点”表示，节点之间的相互作用以“边”表示。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）网络构建与分析将骨松益骨方活性成分治疗绝经后骨质疏松症的潜在作用靶点导入STRING 数据库，设置筛选条件：置信度分数（Score）＞0.9，同时隐藏网络中无联系的节点，构建PPI网络。将结果输入R语言计算，并将排前25位的靶点绘制成柱形图，即得骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松症的关键靶点。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析将中药-疾病靶标利用R语言相关数据包计算，筛选条件：P＜0.05且Q值＜0.05，得到GO生物功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。

1.6 动物实验探究骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松的作用机制

1.6.1动物 SPF级6月龄未孕雌性SD大鼠40只，体质量（280±30）g，购自河南省实验动物中心，生产许可合格证号：SCXK（豫）2017-0001，动物质量合格证号：DW2019050005。动物饲养在温度控制为（26±0.5）℃、湿度为50%、以及12 h光/暗交替环境中。动物实验经河南省洛阳正骨医院动物实验伦理委员会批准，批准号：KY2021-006-02。

1.6.2药物及试剂 骨松益骨方由黄芪、党参、当归、杜仲、淫羊藿、延胡索、制没药、鸡血藤组成，每剂总质量127 g，中药饮片购自河南省洛阳正骨医院中药房。中药饮片加适量水浸泡30 min，加热煮沸后文火煎30 min，倒出药液，纱布过滤；残渣再煎1次，倒出药液。将2次水煎液混合，置70 ℃恒温水浴，浓缩药液至4.62 g·mL-1，4 ℃保存备用。戊巴比妥钠注射液，北京化学试剂公司，批号：AM00469；LY294002，美国MCE 公司，批号：HY-10108；羊抗兔二抗兔源抗GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT 及p-AKT 一抗，美国Abcam 公司，批号分别为 ： ab181602、ab151549、ab138364、ab179463、ab38449；BCA 试剂盒、HE 染色试剂盒、RIPA 裂解液，上海碧云天公司，批号分别为：P0011、C0105、P0013K；其余试剂均为国产分析纯。

1.6.3仪器 SMZ745 光学显微镜，日本尼康公司；XElx800 酶标仪，美国Perkin Elmer 公司；1659001蛋白电泳仪、Trans-Blot Turbo转膜仪，美国Bio-Rad公司；Centrifuge5424R 低温高速离心机，德国Eppendorf股份公司；GIS-500凝胶成像仪，Miulab公司；ABI7500型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪，美国ABI公司。

1.6.4分组及模型复制 将60只大鼠按体质量随机分为假手术组，模型组，骨松益骨方低、中、高剂量组，骨松益骨方高剂量+LY294002（PI3K/Akt 通路抑制剂）组，每组10只，分笼喂养。模型组，骨松益骨方低、中、高剂量组及骨松益骨方+LY294002组采用摘除双侧卵巢法进行模型复制[7]；假手术组同样采取背侧入路，但是仅切除卵巢周围等体积大小脂肪。术后给予一次肌肉注射苄星青霉素（200 U·g-1）预防感染，自由进食水，12 h 光照周期。切除大鼠卵巢后4 周，血中雌激素水平即可出现明显降低，HE 染色出现骨质疏松病理变化，标志绝经后骨质疏松模型复制成功[7-8]。

1.6.5给药 术后4 周开始灌胃给药，给药剂量以临床成人常用剂量（按70 kg计算）并按照人和大鼠体表面积折算，骨松益骨方低、中、高剂量组给药剂量分别为1.25、2.5、5 g·kg-1中药药液，同时以0.3 mg·kg-1的剂量尾静脉注射生理盐水；骨松益骨方高剂量+LY294002组以5 g·kg-1中药药液灌胃，同时以0.3 mg·kg-1的剂量尾静脉注射LY294002；假手术组及模型组以等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃，同时以0.3 mg·kg-1的剂量进行尾静脉注射生理盐水，每天1次，给药时间为12周。给药结束后采用3%戊巴比妥钠（1.5 mL·kg-1）腹腔注射进行麻醉，取左侧股骨和胫骨，去除周围软组织，将股骨放入4%多聚甲醛保存，用石蜡包埋，切片，并进行HE 染色；胫骨放入-80℃冰箱保存，供荧光定量PCR和Western Blot检测。

1.6.6检测指标 将剥离干净的股骨远端脱钙后用HE染色，在光学显微镜下观察骨组织结构变化。提取大鼠胫骨近端总RNA，通过实时荧光定量PCR 对PI3K和Akt的mRNA 水平进行分析，并采用2-△△Ct法计算mRNA 相对表达量。提取大鼠胫骨近端总蛋白，采用Western Blot 法进行PI3K、Akt 蛋白定量。PI3K、Akt 的引物序列及产物长度见表1，引物由大连TaKaRa生物工程公司设计合成。

表1 PI3K、Akt 的引物序列及产物长度Table 1 Primer sequences and product length for PI3K and Akt

1.6.7统计学处理方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量结果以均数±标准差（±s）表示，多组之间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较用t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨松益骨方活性成分及相关靶基因在TCMSP数据库检索关键词“黄芪”“党参”“当归”“淫羊藿”“杜仲”“延胡索”“制没药”“鸡血藤”并以OB≥30%和DL≥0.18进行筛选，分别得到20、21、2、23、28、49、45、24个活性成分。选择“RelatedTargets”，筛选中药活性成分所对应的靶基因，将无法找到相关靶基因的药物活性成分除外后，分别得到黄芪315 个靶基因、党参257 个靶基因、当归185 个靶基因、淫羊藿291个靶基因、杜仲374个靶基因、延胡索659 个靶基因、没药242 个靶基因、鸡血藤305 个靶基因。将靶基因导入UniProt 转换成对应的基因名称，去除重复后，得到骨松益骨方活性成分靶基因共118个。

2.2 有效成分靶基因和绝经后骨质疏松症靶基因的交集利用GeneCards、TTD、PharmGkb、OMIM 四个数据库， 输入关键词“postmenopausal osteoporosis”，搜索绝经后骨质疏松症相关的靶基因，分别得1 139、4、15 和10 个疾病靶基因，删除重复基因后共获得1 155个基因。利用R语言将活性成分靶基因和绝经后骨质疏松症靶基因取交集，得到70 个交集靶基因，同时绘制韦恩图（见图1）。这70 个交集靶基因即为骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松症的潜在作用靶基因。

图1 骨松益骨方-绝经后骨质疏松症靶点的韦恩图Figure 1 Venn diagram of Gusong Yigu Decoction-targets of postmenopausal osteoporosis

2.3 “药物活性成分-作用靶点”网络的构建利用Cytoscape 软件，对骨松益骨方活性成分与交集基因靶点关系进行可视化分析，绘制“药物活性成分-作用靶点”网络图，并进行拓扑分析，依据参数度值（degree）和紧密中心性（closeness centrality，CC）的中位数筛选核心网络，见图2。经统计，共得到91个活性成分，其中degree 较高的活性成分包括：槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、7-O-甲基异木糖醇（7-O-methylisomucronulatol）、异鼠李素（isorhamnetin）、7-甲氧基-2-甲基异黄酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、脱水淫羊藿素（Anhydroicaritin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、8-O-甲基雷乌西（8-O-Methylreyusi）、甘草查尔酮a（licochalcone a）等。骨松益骨方作用于绝经后骨质疏松症的相关靶基因共70 个，degree 较高的关键靶基因为核受体辅激活蛋白2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、热休克蛋白90α 编码基因（Heat Shock Protein 90 AlphaFamily Class A Member 1，HSP90AA1）、前列腺素氧化环化酶1（Prostaglandin-Endoperoxide Synthase1，PTGS1）、雄激素受体（androgenreceptor，AR）、雌激素受体1（Estrogen Receptor 1，ESR1）、孕酮受体（Progesterone Receptor，PGR）、丝氨酸蛋白酶1（PRSS1）、过氧化物酶体增生激活受体γ（Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma，PPARG）。以上活性成分和靶基因可能是骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松症的关键活性成分以及靶基因。

图2 骨松益骨方“药物活性成分-作用靶点”网络图Figure 2 Network of “active ingredients-targets” of Gusong Yigu Decoction

2.4 PPI 网络构建见图3，运用STRING 数据平台对得到的潜在靶点进行分析，构建靶点之间的PPI网络。共得到70 种蛋白之间的互作关系，显示关系189 条。其中节点代表靶蛋白，边代表2 种蛋白的网络互作关系。网络拓扑结构筛选，可以得到这个网络图中位于核心位置的枢纽蛋白，包括ESR1、CTNNB1、HSP90AA1、FOS、AR、RELA、NCOA1等。再借助R 语言统计各节点的边的数量，并将Count 值排前25 位的靶基因绘制成柱形图，见图4。

图3 骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松症的蛋白相互作用（PPI）网络Figure 3 PPI network of GusongYigu Decoction against postmenopausal osteoporosis

图4 骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松症的关键靶点蛋白Figure 4 Core targets of GusongYigu Decoction against postmenopausal osteoporosis

表2 骨松益骨方对模型大鼠胫骨近端骨组织中PI3K、Akt mRNA 表达的影响（±s，n=10）Table 2 Effects of Gusong Yigu Decoction on mRNA expressions of PI3K，Akt in bone tissue of proximal tibia of model rats（±s，n=10）

表2 骨松益骨方对模型大鼠胫骨近端骨组织中PI3K、Akt mRNA 表达的影响（±s，n=10）Table 2 Effects of Gusong Yigu Decoction on mRNA expressions of PI3K，Akt in bone tissue of proximal tibia of model rats（±s，n=10）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与骨松益骨方高剂量组比较，△△P＜0.01

Akt 1.15±0.22 0.62±0.08**1.07±0.15##0.59±0.07△△组别假手术组模型组骨松益骨方高剂量组骨松益骨方高剂量+LY294002组PI3K 1.03±0.17 0.56±0.06**0.99±0.12##0.53±0.05△△

2.5 GO 富集分析和KEGG 通路分析GO富集分析共得到1 926条富集结果，其中生物过程（BP）1 789个，主要涉及对类固醇激素的反应、对金属离子的反应、对辐射的反应等；细胞组分（CC）40 个，主要包括膜筏、膜微域、膜区等；分子功能（MF）97个，主要有脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）结合转录激活剂活性、核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）聚合酶Ⅱ特异性，泛素蛋白连接酶结合等。取排前10位的GO富集分析气泡图，见图5。

图5 骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松症的GO 富集分析气泡图（前10 位）Figure 5 Bubble diagram of GO functional enrichment analysis for Gusong Yigu Decoction against postmenopausal osteoporosis（top 10）

KEGG富集分析共得到42条富集通路，主要涉及PI3K/Akt 信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、细胞凋亡、内分泌抵抗、MAPK 信号通路、铂类药物耐药性、p53 信号通路、白细胞介素（Interleukin，IL）-17 信号通路等，提示骨松益骨方可能通过以上信号通路对绝经后骨质疏松症发挥治疗作用。取排前30 位作KEGG 富集分析气泡图，见图6。

图6 骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松症的KEGG 通路分析气泡图（前30 位）Figure 6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis for Gusong Yigu Decoction against postmenopausal osteoporosis（top 30）

2.6 骨松益骨方对模型大鼠股骨远端骨组织形态的影响见图7。假手术组大鼠骨组织形态正常，模型组大鼠骨组织呈现骨小梁明显稀疏、变细、无网状结构，皮质骨变薄等病理变化。与模型组比较，骨松益骨方低、中、高剂量组在骨小梁的数量、分布、连续性等方面明显改善。与骨松益骨方高剂量组比较，骨松益骨方高剂量+LY294002 组大鼠骨组织病理损伤明显加重。

图7 HE 染色检测各组大鼠骨组织形态（×100）Figure 7 The bone histomorphology of rats in each group detected by HE staining（×100）

2.7 骨松益骨方对模型大鼠胫骨近端骨组织中PI3K、Akt mRNA 表达的影响见表2。与假手术组比较，模型组大鼠胫骨近端骨组织中PI3K、Akt mRNA的表达水平均明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，骨松益骨方高剂量组大鼠胫骨近端骨组织中PI3K、Akt mRNA 的表达水平均明显升高（P＜0.01）。与骨松益骨方高剂量组比较，骨松益骨方高剂量+LY294002 组大鼠胫骨近端骨组织中PI3K、Akt mRNA的表达水平均明显降低（P＜0.01）。

2.8 骨松益骨方对模型大鼠胫骨近端骨组织中PI3K、Akt 蛋白表达的影响见图8、表3。与假手术组比较，模型组大鼠胫骨近端骨组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，骨松益骨方高剂量组大鼠胫骨近端骨组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt明显升高（P＜0.01）。与骨松益骨方高剂量组比较，骨松益骨方高剂量+LY294002组大鼠胫骨组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 明显降低（P＜0.01）。

图8 骨松益骨方对模型大鼠胫骨组织中PI3K、Akt 蛋白表达影响的电泳图Figure 8 Electrophoretogram of the effects of Gusong Yigu Decoction on protein expressions of PI3K and Akt in bone tissue of proximal tibia of model rats

表3 骨松益骨方对模型大鼠胫骨近端组织中PI3K、Akt蛋白表达的影响（±s，n=10）Table 3 Effects of Gusong Yigu Decoction on protein expressions of PI3K and Akt in bone tissue of proximal tibia of model rats（±s，n=10）

表3 骨松益骨方对模型大鼠胫骨近端组织中PI3K、Akt蛋白表达的影响（±s，n=10）Table 3 Effects of Gusong Yigu Decoction on protein expressions of PI3K and Akt in bone tissue of proximal tibia of model rats（±s，n=10）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与骨松益骨方高剂量组比较，△△P＜0.01

p-Akt/Akt 0.94±0.16 0.42±0.10**0.68±0.12##0.35±0.09△△组别假手术组模型组骨松益骨方高剂量组骨松益骨方高剂量+LY294002 组p-PI3K/PI3K 0.78±0.11 0.26±0.08**0.82±0.13##0.14±0.06△△

3 讨论

骨松益骨方已被证实[3-4]能提高骨质疏松症患者骨密度，有效改善患者临床症状，且不良反应小。本研究结合网络药理学和实验验证，探讨骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松症的机制。

基于网络药理学方法，共筛选得到91 个有效成分和70个中药-疾病靶点，其中槲皮素、山柰酚、木犀草素、7-O-甲基异木糖醇等活性成分对应靶点较多，是骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松症的活性成分。有研究[9-11]表明，槲皮素，山柰酚，木犀草素、异鼠李素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮均为黄酮类化合物，具有植物雌激素样作用，能够清除衰老的骨髓间充质干细胞（BMMSCs）和内皮细胞并抑制其衰老，加快BMMSCs 的增殖及分化，上调RUNX2、OSX 等成骨分化相关基因的表达，增强BMP 信号传导，促进成骨分化等，从而防治骨质疏松。脱水淫羊藿素通过拮抗选择性雌激素受体β信号通路，使UMR106成骨样细胞分化、增殖加快，同时抑制RAW264.7破骨样细胞形成和破骨细胞的骨吸收[12]。β-谷甾醇也可表现出雌激素样作用，主要通过影响成骨细胞增殖、抑制破骨细胞活性、增加骨密度来防治骨质疏松[13]。另外，槲皮素、山奈酚、异鼠李素等通过降低活性氧水平或发挥雌激素样作用，从而改善氧化应激状态，逆转骨代谢[14-15]。闵珺[16]研究表明，PI3K/AKT/FoxO/NF-κB通路是调节细胞凋亡与氧化平衡的另一条重要通路，槲皮素可激活此通路促进成骨分化，进而改善OP状态。因此，骨松益骨方活性成分主要通过促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞形成，以及抗氧化、抗炎等作用对抗绝经后骨质疏松症。

绝经后妇女快速骨丢失的主要机制即为雌激素缺乏，雌激素可加速破骨细胞凋亡、抑制破骨细胞活性，从而调控骨骼稳态[17]。而雌激素缺乏势必会加重骨质疏松的进程，破骨细胞又是体内唯一具有骨吸收功能的细胞，因此调控雌激素及破骨细胞可以有效干预绝经后骨质疏松症[18]。PPI 网络筛选出骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松症的关键靶点蛋白有ESR1、CTNNB1、HSP90AA1、FOS、AR、RELA、NCOA1等，其中排第一位的ESR1与破骨细胞的形成关系密切。ESR1 编码雌激素受体可调节机体内雌激素水平，其mRNA 表达与雌激素增殖基因、调节基因mRNA表达呈正相关[19]。韩林静等[20]证实，ESR1作为雌激素通路上的核心靶点基因，通过控制骨代谢和峰值的获取，抑制骨损失来维持体内骨量平衡及骨生长。HSP90AA1是一种热休克蛋白，具有维持细胞蛋白稳态及正常功能的作用，下调HSP90AA1可以调控MAPK通路中与成骨相关的转录因子，使间充质干细胞（MSCs）向成骨方向分化[21-22]。雄激素调控骨代谢基于AR 介导，AR 在MSCs、成骨、破骨细胞和骨细胞中皆可明显表达，其能够抑制破骨细胞分化，同时促进MSCs 向成骨细胞分化以及成骨细胞骨化、矿化等，调控机制与Wnt /β-catenin、MAPK、BMP /SmadsRunx2 等通路有关[23]。

根据GO 富集分析，骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松症可能通过影响细胞对类固醇激素的反应、对金属离子的反应、对氧化应激的反应等多个BP 过程；CC层面主要涵盖了转录因子复合物等；从MF层面来看骨松益骨方通过调控酶活性、转录因子等抗骨质疏松症。KEGG通路富集分析结果显示，骨松益骨方作用绝经后骨质疏松症的靶点主要涉及PI3K/Akt信号通路、TNF 信号通路、细胞凋亡、内分泌抵抗、MAPK 信号通路、铂类药物耐药性、p53 信号通路、IL-17 信号通路等。①PI3K/Akt 信号通路：PI3K/Akt信号通路主要影响体内细胞的分化、生长和凋亡、激活，其可刺激成骨细胞的分化和生长，同时抑制其凋亡[24]；此外，PI3K 通路还可以通过刺激破骨细胞肌动蛋白丝的形成，进而调节破骨细胞的趋化、附着和扩散等，抑制PI3K 信号通路的表达能减少成熟破骨细胞的骨吸收[25]。②TNF信号通路：引发骨质疏松症最直接原因之一是体内破骨细胞的增加，而NF-κB 受体活化因子配体（RANKL）作为TNF 超家族的一员，影响着骨细胞的成熟分化[26]。此外，炎症因子也是影响骨质疏松发生的关键因素之一[27]；炎症因子（如IL、TNF 等）的释放可以激活NF-κB 通路，造成细胞损伤，诱导基因突变引发肿瘤[28]。因此，这可能是导致检索绝经后骨质疏松症通路时经常会检索到肿瘤相关通路的原因。③MAPK 信号通路：MAPK是细胞内一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，既可以促进成骨细胞的增殖和分化，又能抑制骨吸收[29]。激活MAPK信号通路可以加快BMP-2、ALP的表达及成骨细胞矿化，从而促使骨的形成。而当MAPK下游因子ERK失活时，又可以抑制破骨细胞形成和活化[30]。沈云玲[31]等发现调控NF-κB和MAPK信号通路可以有效延缓大鼠骨质疏松症的发展。④IL-17信号通路：阻断IL-17信号通路，可以延缓破骨细胞吸收，用于预防雌激素缺乏性骨丢失；而IL-17受体缺失的小鼠模型行卵巢切除术后，未因雌激素缺失使骨小梁减少[32]。刘连勇等[33]研究发现，IL-17 信号通路介导的炎性反应可以破坏细胞外基质及软骨合成，抑制胶原修复基质和蛋白聚糖，进而调控骨质疏松病理生理过程。另外有研究[34]发现，抗IL-17抗体可以使受损骨组织中成骨标志物水平升高，减轻氧化应激损伤，提升骨骼再生能力，进而增强骨质疏松性骨折的骨愈合和骨再生的能力。对上述通路分析发现，骨松益骨方主要在促进成骨、抑制破骨及抗炎等方面维持骨代谢动态平衡，从而有效治疗绝经后骨质疏松症。

在动物验证实验中，我们主要研究了骨松益骨方对PI3K/Akt信号通路的影响。PI3K/Akt细胞信号通路通过促进成骨细胞增殖、分化和骨形成而参与骨质疏松的抑制。建立绝经后骨质疏松症大鼠模型，通过检测各组大鼠骨组织结构变化及PI3K/Akt 信号通路相关mRNA 和蛋白表达情况，进一步验证骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松症的作用机制。实验结果表明，骨松益骨方可有效改善模型组大鼠骨小梁的组织形态；并可明显提升PI3K、Akt mRNA以及磷酸化的PI3K、Akt蛋白表达水平，提示骨松益骨方可能通过激活PI3K/Akt 信号通路发挥抗绝经后骨质疏松症作用。

综上所述，本研究利用网络药理学构建“中药-成分-疾病-靶点-通路”多层网络，阐明骨松益骨方通过多成分、多靶点、多途径治疗绝经后骨质疏松症，并佐以实验验证，为深入研究骨松益骨方治疗绝经后骨质疏松症的机制提供了新视角；但本研究受限于网络数据库的不全面及时效性，结果也具有一定的局限性，需要更多体内外实验数据支持。因此课题组后续将在此基础上继续开展生物学实验验证，以确保数据的准确性和可靠性。