柴黄益肾颗粒抑制巨噬细胞Mincle 改善小鼠慢性肾病模型肾纤维化

2023-12-20谭睿陟邹远霞刘鹏粟宏伟李平王丽西南医科大学附属中医医院中西医结合研究中心四川泸州66000北京中医医院顺义医院肾病科北京00西南医科大学附属中医医院泌尿外科四川泸州66000北京中日友好医院临床医学研究所免疫介导炎症疾病北京重点实验室北京0009

中药新药与临床药理 2023年12期

关键词：单侧输尿管纤维化

谭睿陟，邹远霞，刘鹏，粟宏伟，李平，王丽（.西南医科大学附属中医医院中西医结合研究中心，四川泸州 66000；. 北京中医医院顺义医院肾病科，北京 00；. 西南医科大学附属中医医院泌尿外科，四川泸州 66000；. 北京中日友好医院临床医学研究所免疫介导炎症疾病北京重点实验室，北京 0009）

慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease，CKD）的发病率不断升高，近十年以来，慢性肾脏病患病率增加了29.3%[1]，目前其患病人数占全球总人数的10%～13%[2]，已成为一个主要的公共卫生问题。慢性肾脏病的风险随着年龄的增长而增加，且高血压、糖尿病、心血管疾病、肾毒素、急性肾损伤等都是慢性肾脏病的危险因素[3]。近年来的研究[4]表明，肾脏纤维化是慢性肾脏病的主要病理表现，其进行性的特征不仅损害肾脏，还会损害心脏，被认为是诱发慢性肾脏病患者极高发病率和死亡率的重要原因。值得注意的是，纤维化过程的早期阶段以涉及先天免疫和适应性免疫的复杂炎症事件为特征[5]。而在器官损伤的早期阶段，纤维化通常是由持续数月的免疫反应诱导的慢性炎症引起的[6]。其中巨噬细胞是一类重要的炎症细胞，在慢性肾脏病炎症和纤维化中具有关键的促进作用[7]。已有研究[8-9]报道，巨噬细胞可诱导C 型凝集素（Macrophage-inducible C-type lectin，Mincle）是巨噬细胞表面促炎症的受体，在多种肾脏损伤中扮演重要角色。

柴黄益肾颗粒（ChaihuangYishenGranules），又称芪龙利水方（由七味药，柴胡、黄芪、当归、穿山龙、石韦、猪苓、水蛭组成），起源于著名中医师时振声治疗慢性肾病的临床经验[10]，是由北京中日友好医院肾病科李平研究员结合时振声教授临床经验开发的慢性肾病治疗中药复方，已于2008 年获得国家药监局颁发的临床试验批件。该方目前已在临床被用于治疗慢性肾脏疾病，并在减少蛋白尿、降低肾脏纤维化、抑制炎症方面具有明显效果[11-12]，但具体机制还未阐明。

本研究拟采用单侧输尿管结扎（Unilateral Ureteral Obstruction，UUO）法诱导慢性肾脏损伤和纤维化，运用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法、流式细胞术和Western Blot等方法观察柴黄益肾颗粒对UUO 小鼠肾脏炎症、纤维化和损伤的改善作用，及巨噬细胞炎症响应关键分子Mincle 是否为柴黄益肾颗粒干预UUO 肾脏损伤和纤维化的关键靶点，以期探讨柴黄益肾颗粒对UUO 小鼠肾损伤和纤维化的保护作用及其与巨噬细胞Mincle的调控作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级雄性C57BL/6 小鼠，22～25 g，36 只，8 周龄大小，购自成都药康生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK（川）2020-034，动物质量合格证号：511214900004452。所有小鼠均饲养于西南医科大学动物实验中心动物房内，温度为20～23 ℃，相对湿度为40%～60%，12 h/12 h 明暗交替。本实验所涉及的动物实验方案已通过西南医科大学实验动物伦理委员会批准，审批编号为：20211122-079。

1.2 主要药品和试剂柴黄益肾颗粒免煎剂（组方含柴胡、黄芪、当归、穿山龙、石韦、猪苓、水蛭），由西南医科大学附属中医医院制剂室制备；免疫组化试剂盒，批号：PV-9000，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；小鼠白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司，批号分别为：EMC001b、EMC004、EMC102a；小鼠Mincle抗体，批号：sc-390806，购自美国Santa Cruz 公司；小鼠纤维粘连蛋白（fibronectin，Fn）和α-肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体均购自上海艾比玛特医药科技有限公司，批号分别为：T59537、TA1032；小鼠磷酸化核因子-kappa B（phosphorylated-nuclear factor-kappa B，p-NK-κB）、核因子-kappa B（nuclear factor-kappa B，NK-κB）、磷酸化脾酪氨酸激酶（phosphorylated-spleen tyrosine kinase，p-Syk）、脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）抗体均购自美国Cell Signaling Technology 公司，批号分别为：3033S、8242S、2717S、13198S；Mincle激动剂海藻糖-6，6-二苯甲酸酯（trehalose-6，6-dibehenate，TDB）试剂购自美国InvivoGen 公司，批号：tlrl-tdb；cDNA 逆转录试剂（批号：R323-01）、荧光定量PCR试剂（批号：Q711-03），均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 主要仪器FACSCanto Ⅱ流式细胞仪，美国BD公司；Synergy2 酶标仪，美国BioTek 公司；RM2255型组织切片系统、ICC50W 显微镜，德国Leica 公司；ChemiDoc XRS+型凝胶成像系统、Mini-Protein Tetra system型蛋白质电泳转印系统，美国Bio-Rad公司；LightCycler480 Ⅱ型实时荧光定量聚合酶链反应仪，瑞士Roche公司； NANODROP 2000型超微量分光光度计、EVOS荧光显微镜，美国Thermo公司。

1.4 分组、给药及采样将36只小鼠适应性饲养1周后，随机分为假手术组、模型组、柴黄益肾颗粒低剂量组、柴黄益肾颗粒高剂量组、阳性对照厄贝沙坦组和柴黄益肾颗粒高剂量+TDB 组，每组6 只小鼠。术后1 h，柴黄益肾颗粒低、高剂量组及柴黄益肾颗粒高剂量+TDB 组分别灌胃免煎剂3.835、7.67、7.67 g·kg-1（药物剂量按照人免煎剂每日用量25.287 g换算），阳性对照组灌胃厄贝沙坦20 mg·kg-1，假手术组、模型组小鼠灌胃等量生理盐水，每日1 次，连续灌胃7 d。柴黄益肾颗粒高剂量+TDB组于术后1 h一次性腹腔注射10 mg·kg-1TDB。造模7 d后，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，经心脏采血后迅速分离肾脏组织。

1.5 单侧输尿管结扎（UUO）造模[13]模型组和各药物干预组小鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠后，腹部朝下平卧在手术台上。左侧大腿根部附近皮肤去毛，用75%乙醇消毒，纵向剪开该处皮肤约1 cm，并随后剪开下方的肌肉层1 cm。用镊子轻轻拉出肾脏相连的脂肪垫，将肾脏带出。用镊子从肾脏下极脂肪慢慢梳理出白色输尿管，并用缝合线在输尿管上做两次结扎，两次结扎位置相邻0.5 cm，随后从结扎的中间剪断输尿管。将肾脏放回腹腔内部，依次缝合肌肉层和皮肤层，并消毒。实验过程中保持室温（25±2）℃，术后给小鼠保暖直至苏醒。

1.6 肾脏组织形态的观察按“1.4”项下取得的各组肾脏组织，于4%多聚甲醛固定48 h，采用常规石蜡包埋对组织进行处理。随后将包埋的肾脏进行切片，切片厚度为4 μm。获得的肾脏切片随后进行脱蜡、复水后采用苏木精-伊红染色（苏木精染色5 min，伊红染色40 s）和天狼星红染色进行组织病理染色。将染色完成的切片晾干后用中性树胶封片。采用莱卡光学显微镜观察和拍摄各组小鼠肾脏病理变化。

1.7 免疫组织化学法检测小鼠肾脏组织中α-SMA 的表达各组小鼠肾脏组织固定、包埋、切片、脱蜡、复水后用柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）微波修复抗原。随后用5% BSA 对组织切片进行室温封闭30 min。对组织滴加α-SMA（1∶200 稀释）一抗4 ℃孵育过夜后加生物素标记的二抗（稀释比例为1∶1 000），并用DAB（稀释20 倍）显色，苏木精染细胞核后晾干封片。采用莱卡光学显微镜观察和拍摄各组小鼠肾脏组织中α-SMA的着色情况。

1.8 免疫荧光法检测小鼠肾脏组织中Mincle 的表达获得的各组肾脏组织经固定、脱水后，采用OCT 包埋。将肾脏组织切片后滴加0.5%破膜剂室温处理15 min，并用5% FBS 对组织切片封闭30 min；滴加Mincle 一抗（1∶50）4 ℃孵育过夜；PBS 清洗2 次后，滴加FITC 二抗（1∶200）孵育组织1 h，随后清洗组织2 次；滴加DAPI工作液，并封片；采用EVOS显微镜观察各组肾脏中Mincle的荧光表达情况。

1.9 ELISA 检测肾脏组织匀浆中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的浓度收集小鼠肾脏后制备组织匀浆，并稀释10 倍；向反应孔中加入小鼠肾脏组织匀浆稀释液以及不同浓度的标准品，37 ℃孵育90 min；用洗涤液清洗5 次后，加入生物素化抗体工作液，37 ℃处理60 min；清洗5 次后加入酶结合物工作液37 ℃避光孵育30 min；最后以此加入显色底物和终止液，在450 nm 波长下测量OD 值，并绘制标准曲线，根据标准曲线计算出各样本中IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度。

1.10 Real-time PCR 法检测肾脏组织中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的mRNA 表达水平运用Trizol 试剂提取组织样本的RNA，并吸取1 μg RNA用于逆转录。取获得的cDNA 1 μL 用于PCR 鉴定。实时定量PCR 反应体系：5 μL SYBR mix，1 μL cDNA，1 μL正向+反向引物，3 μL ddH2O。实时定量PCR反应程序：95 ℃、5min，40 个循环（95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、20 s），72 ℃、7 min，4 ℃保存。根据获得的CT值计算基因的相对表达量。

1.11 流式细胞术检测肾脏组织中表达Mincle 的巨噬细胞数量取新鲜的肾脏组织置于6 孔板的2 mL 培养基中，用剪刀将组织剪碎；加入60 μL胶原Ⅳ消化液，以1 500 r·min-1、37 ℃震荡消化15 min后用枪头将组织吹散，再消化15 min；以1 500 r·min-1离心5 min（离心半径10.5 cm）后用红细胞裂解液破红，并过70 μm细胞筛；将得到的细胞以1 500 r·min-1离心5 min（离心半径10.5 cm）后加入4%多聚甲醛室温固定30 min；PBS清洗2次后加入5% BSA固定30 min。随后加入Mincle 和F4/80 一抗于4 ℃孵育过夜；PBS清洗2 次后加入FITC 和APC 荧光二抗，避光室温孵育1 h；在流式细胞仪中根据单染划门，并检测各细胞荧光表达情况。

1.12 Western Blot 法检测肾脏组织中多种蛋白表达SDS-PAGE 胶中每孔上样70 μg蛋白后电泳，将凝胶中的蛋白转膜至0.22 μm的PVDF膜上，5%BSA室温封闭1 h，随后加入对应的一抗，4 ℃孵育过夜；按照抗体来源加入对应的辣根酶标记的抗鼠或抗兔二抗（1∶3 000），室温孵育1 h；将膜放入超敏化学发光试剂中10～30 s并拍照；采用ImageJ 软件读取条带灰度值。

1.13 统计学处理方法采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，数据以均数± 标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，并用沃勒-邓肯法及邓尼特法进行事后多重比较，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对UUO 小鼠肾脏损伤和纤维化的影响见图1。苏木精-伊红染色结果显示，与假手术组比较，模型组肾脏病理损伤严重，肾小管上皮细胞肿胀脱落、坏死和免疫细胞浸润明显增加；与模型组比，柴黄益肾颗粒低剂量组、高剂量组对小鼠肾组织病理损伤均有所减弱，其中高剂量组的改善效果较好。天狼星红染色结果显示，与假手术组比，模型组间质深色着色区域明显增加，表明肾脏中间质纤维化明显；与模型组比，柴黄益肾颗粒低剂量组、高剂量组对小鼠肾组织间质纤维化均有所减轻，其中高剂量组抗肾脏纤维化效果较好。

图1 柴黄益肾颗粒对单侧输尿管结扎（UUO）诱导的模型小鼠肾纤维化和肾损伤的影响（苏木精-伊红染色，天狼星红染色，×200）Figure 1 Effect of Chaihuang Yishen Granule on UUO-induced renal fibrosis and injury（HE and Sirius Red staining，×200）

2.2 对UUO 小鼠肾脏α-SMA 表达的影响结果见图2。免疫组化结果显示，与假手术组比较，模型组肾脏间质α-SMA着色区域明显增加；与模型组比，柴黄益肾颗粒低剂量组、高剂量组中小鼠肾组织α-SMA表达有所减弱，其中高剂量组α-SMA表达减少更多。

图2 柴黄益肾颗粒对单侧输尿管结扎（UUO）模型小鼠肾脏中α-SMA 表达的影响（免疫组化，×200）Figure 2 The effect of Chaihuang Yishen Granules on expression of a-SMA in kidney of UUO mice（IHC，×200）

2.3 对UUO 小鼠肾脏Fn 和α-SMA 蛋白的影响结果见图3和表1。Western Blot结果表明，与假手术组比较，模型组肾脏中纤维化指标Fn和α-SMA蛋白的相对表达量均明显增加（P＜0.01）；与模型组比，柴黄益肾颗粒低、高剂量组中小鼠肾组织Fn和α-SMA蛋白的相对表达量均明显降低（P＜0.01）。

表1 柴黄益肾颗粒对单侧输尿管结扎（UUO）模型小鼠肾脏中Fn 和α-SMA 蛋白表达的影响（±s，n=3）Table 1 Effect of Chaihuang Yishen Granules on the protein expression of Fn and α-SMA in the kidneys of UUO mice（±s，n=3）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01

α-SMA/GAPDH 0.16±0.04 0.98±0.12##0.26±0.07**0.20±0.02**0.34±0.03**组别假手术组模型组柴黄益肾颗粒低剂量组柴黄益肾颗粒高剂量组阳性对照厄贝沙坦组Fn/GAPDH 0.18±0.04 1.15±0.15##0.36±0.04**0.37±0.05**0.61±0.05**

图3 各组小鼠肾脏中Fn 和α-SMA 蛋白表达状况Figure 3 Protein expression of Fn and α-SMA in mice kidneys of each group

2.4 对UUO 小鼠肾脏炎症因子浓度的影响采用ELISA法检测各组小鼠肾脏悬液炎症因子浓度，结果见表2。与假手术组比，模型组小鼠肾脏悬液中炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的浓度明显增加（P＜0.01）；与模型组比，柴黄益肾颗粒低剂量组中炎症因子TNF-α 的含量明显降低（P＜0.05），高剂量组IL-1β、IL-6 及TNF-α 的浓度均明显降低（P＜0.01），表明柴黄益肾颗粒具有明显的抗炎症作用。

表2 柴黄益肾颗粒对单侧输尿管结扎（UUO）模型小鼠肾脏中IL-1β、IL-6 和TNF-α 浓度的影响（±s，n=6）Table 2Effect of Chaihuang Yishen Granules on the concentrations of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the kidneys of UUO mice（±s，n=6）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

TNF-α/（pg·mL-1）74.61±7.75 363.55±35.51##295.58±10.25*181.14±22.87**197.65±32.21**组别假手术组模型组柴黄益肾颗粒低剂量组柴黄益肾颗粒高剂量组阳性对照厄贝沙坦组IL-1β/（pg·mL-1）98.68±34.08 356.71±41.49##287.05±27.45 172.11±51.23**203.49±19.57**IL-6/（pg·mL-1）126.83±51.74 715.37±31.59##609.66±48.36 342.82±63.40**373.04±73.85**

2.5 对UUO 小鼠肾脏NF-κB 活性的影响结果见图4 和表3。与假手术组比较，模型组肾脏中炎症关键蛋白NF-κB的磷酸化水平明显增加（P＜0.01）；与模型组比，柴黄益肾颗粒高剂量组中小鼠肾组织NF-κB的磷酸化水平明显降低（P＜0.01）。

表3 柴黄益肾颗粒对单侧输尿管结扎（UUO）模型小鼠肾脏中NF-κB 磷酸化的影响（±s，n=3）Table 3 Effect of Chaihuang Yishen Granules on the protein level of p-NF-κB in the kidneys of UUO mice（±s，n=3）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01

p-NF-κB/NF-κB 0.14±0.04 0.71±0.09##0.62±0.05 0.40±0.06**0.44±0.03**组别假手术组模型组柴黄益肾颗粒低剂量组柴黄益肾颗粒高剂量组阳性对照厄贝沙坦组

图4 各组小鼠肾脏中NF-κB 磷酸化的状况Figure 4 Phosphorylation of NF-κB in the mice kidneys of each group

2.6 对UUO 小鼠肾脏炎症因子mRNA 表达的影响结果见表4。Real-time PCR 结果表明，与假手术组比，模型组小鼠肾脏中炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的mRNA 表达均明显增加（P＜0.01）；与模型组比，柴黄益肾颗粒高剂量组中以上炎症因子的表达量均明显降低（P＜0.01）。

表4 柴黄益肾颗粒对单侧输尿管结扎（UUO）模型小鼠肾脏中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表达的影响（±s，n=6）Table 4 Effect of Chaihuang Yishen Granules on the mRNA levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the kidneys of UUO mice（±s，n=6）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

TNF-α 5.0×10-4±1.2×10-4 6.8×10-2±9.4×10-3##2.9×10-2±1.8×10-2*1.3×10-2±4.3×10-3**2.2×10-2±1.0×10-2**组别假手术组模型组柴黄益肾颗粒低剂量组柴黄益肾颗粒高剂量组阳性对照厄贝沙坦组IL-1β 6.1×10-5±3.9×10-5 3.9×10-3±1.3×10-3##8.6×10-4±4.5×10-4**4.1×10-4±1.8×10-4**8.8×10-4±1.0×10-4**IL-6 6.8×10-6±2.4×10-6 1.4×10-4±4.6×10-5##8.0×10-5±2.2×10-5 3.9×10-5±1.5×10-5**4.8×10-5±8.5×10-6**

2.7 对UUO 小鼠肾脏巨噬细胞Mincle 表达的影响结果见图5。免疫荧光结果显示Mincle（绿色荧光）主要表达于肾脏间质，与假手术组比，模型组小鼠肾脏间质中绿色荧光明显增加，表明Mincle 表达明显升高；与模型组比，柴黄益肾颗粒高剂量组能有效减少绿色荧光，抑制Mincle的表达。

图5 柴黄益肾颗粒对单侧输尿管结扎（UUO）模型小鼠肾脏中Mincle 表达的影响（免疫荧光）Figure 5 The effect of Chaihuang Yishen Granules on expression of Mincle in kidney of UUO mice（IF）

2.8 对UUO 小鼠肾脏Mincle 蛋白的影响结果见图6和表5。Western Blot 结果表明，与假手术组比较，模型组肾脏中Mincle及其下游的磷酸化Syk蛋白的相对表达量均明显增加（P＜0.01）；与模型组比，柴黄益肾颗粒高剂量组中小鼠肾组织Mincle 和磷酸化Syk蛋白的相对表达量均明显降低（P＜0.01）。

表5 柴黄益肾颗粒对单侧输尿管结扎（UUO）模型小鼠肾脏中Mincle 蛋白及Syk 磷酸化的影响（±s，n=3）Table 5 Effect of Chaihuang Yishen Granules on the protein levels of Mincle and p-Syk in the kidneys of UUO mice（±s，n=3）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

p-Syk/Syk 0.22±0.03 1.72±0.27##1.15±0.21*0.74±0.09**1.22±0.10*组别假手术组模型组柴黄益肾颗粒低剂量组柴黄益肾颗粒高剂量组阳性对照厄贝沙坦组Mincle/GAPDH 0.09±0.01 1.36±0.19##1.15±0.09 0.41±0.09**0.60±0.15**

图6 各组小鼠肾脏中Mincle 蛋白及Syk 磷酸化的状况Figure 6 Protein levels of Mincle and Syk in the mice kidneys of each group

2.9 对UUO 小鼠肾脏Mincle 阳性巨噬细胞数量的影响结果见图7 和表6。流式细胞术结果显示，与假手术组比较，模型组肾脏中表达Mincle（APC荧光）的巨噬细胞（F4/80 FITC 荧光）比例明显增加（P＜0.01）；与模型组比，柴黄益肾颗粒低、高剂量组中小鼠肾组织中表达Mincle的巨噬细胞比例均明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表6 柴黄益肾颗粒对单侧输尿管结扎（UUO）模型小鼠肾脏中Mincle 在巨噬细胞中表达的影响（±s，%；n=3）Table 6 The effect of Chaihuang Yishen Granules on the expression of Mincle in macrophages in the kidneys of UUO mce（±s，%；n=3）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

Mincle+/（F4/80）+2.24±1.09 18.15±4.17##7.15±0.50*3.63±2.36**7.23±1.95*组别假手术组模型组柴黄益肾颗粒低剂量组柴黄益肾颗粒高剂量组阳性对照厄贝沙坦组

图7 流式细胞术检测各组小鼠肾脏中Mincle 在巨噬细胞中的表达Figure 7 The expression of Mincle in macrophages in the mice kidneys of each group by flow cytometry

2.10 Mincle 配体TDB 对柴黄益肾颗粒抑制UUO 肾脏损伤和纤维化的影响见图8。苏木精-伊红染色结果显示，与柴黄益肾颗粒高剂量组比较，柴黄益肾颗粒高剂量+TDB 组肾脏病理损伤严重，肾小管内皮细胞肿胀脱落、坏死明显增加；天狼星红染色结果显示，与柴黄益肾颗粒高剂量组比较，柴黄益肾颗粒高剂量+TDB组肾脏中间质纤维化增强，说明增加Mincle 表达可抵消柴黄益肾颗粒对UUO 模型小鼠肾脏炎症和纤维化的保护作用。

图8 TDB 恢复了柴黄益肾颗粒抑制的单侧输尿管结扎（UUO）模型小鼠肾纤维化和肾损伤（苏木精-伊红染色，天狼星红染色，×200）Figure 8 TDB reversed the inhibition of Chaihuang Yishen Granules on fibrosis and injury in Chaihuang Yishen Granule treated UUO mice（HE and Sirius Red staining，×200）

2.11 Mincle 配体TDB 对柴黄益肾颗粒抑制UUO模型小鼠肾脏Mincle、α-SMA、Fn、p-NF-κB 和p-Syk 蛋白的影响结果见图9 和表7。与柴黄益肾颗粒高剂量组比较，柴黄益肾颗粒高剂量+TDB组肾脏中Mincle、α-SMA、Fn 及下游信号磷酸化NF-κB及Syk 的蛋白相对表达量均明显增加（P＜0.05，P＜0.01）。

表7 TDB 对柴黄益肾颗粒干预的单侧输尿管结扎（UUO）模型小鼠肾脏中Mincle、α-SMA、Fn 及下游信号磷酸化NF-κB 和Syk 蛋白相对表达量的影响（±s，n=3）Table 7 The protein levels of Mincle，α-SMA，Fn，p-NF-κB and p-Syk in kidney of each group（±s，n=3）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与柴黄益肾颗粒高剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

p-Syk/Syk 0.19±0.03 0.82±0.05##0.22±0.07**0.99±0.07△△组别假手术组模型组柴黄益肾颗粒高剂量组柴黄益肾颗粒高剂量+TDB 组Mincle/GAPDH 0.12±0.03 1.13±0.08##0.53±0.11**1.22±0.10△△α-SMA/GAPDH 0.11±0.01 0.82±0.04##0.28±0.08**0.71±0.07△△Fn/GAPDH 0.76±0.10 2.19±0.11##1.07±0.03**1.45±0.15△p-NF-κB/NF-κB 0.07±0.02 0.88±0.06##0.29±0.04**0.95±0.12△△

图9 TDB 作用下各组小鼠肾脏中Mincle、α-SMA、Fn 及下游信号磷酸化NF-κB 和Syk 蛋白表达量状况Figure 9 The effect of TDB on protein levels of Mincle，α-SMA，Fn，p-NF-κB and p-Syk in Chaihuang Yishen Granules treated kidney of UUO mice

2.12 Mincle 配体TDB 对柴黄益肾颗粒抑制UUO模型小鼠肾脏炎症因子浓度的影响结果见表8。ELISA结果表明，与柴黄益肾颗粒高剂量组比，柴黄益肾颗粒高剂量+TDB 组小鼠肾脏悬液中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度明显增加（P＜0.01）。

表8 TDB 对柴黄益肾颗粒干预的单侧输尿管结扎（UUO）模型小鼠肾脏中IL-1β、IL-6 和TNF-α 浓度的影响（±s，n=3）Table 8 The effect of TDB on concentration of IL-1β，IL-6 and TNF-αin Chaihuang Yishen Granules treated kidney of UUO mice（±s，n=3）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与柴黄益肾颗粒高剂量组比较，△△P＜0.01

TNF-α/（pg·mL-1）66.33±13.61 378.59±45.71##169.02±35.16**320.74±35.92△△组别假手术组模型组柴黄益肾颗粒高剂量组柴黄益肾颗粒高剂量+TDB 组IL-1β/（pg·mL-1）54.33±9.02 389.70±78.69##149.31±29.57**316.02±22.34△△IL-6/（pg·mL-1）137.38±39.55 861.01±75.72##367.34±41.0**678.77±22.50△△

3 讨论

慢性肾脏病是日益严重的健康问题，其在我国的发病率已经达到了10.8%[14]，对人民生命健康以及国家医疗体系造成了很大的危害和负担。慢性肾病在早期阶段可能没有症状，且疾病轨迹难以把握，容易使人忽视对其的治疗，造成严重的后果，比如发展为肾脏衰竭后，只能通过肾脏替代疗法维持生命[15]。因此，探索慢性肾病的发病规律和潜在发病机制，对于疾病的预防和治疗具有重要意义。研究[3]表明，慢性肾炎、高血压、糖尿病、肾毒性药物的不当服用、尿路梗阻等均是诱导慢性肾病的危险因素。在慢性肾病的病理发展过程中，肾脏纤维化被认为是肾脏损伤不可逆的关键病理变化，其是适应不良修复的最终病理过程[4]。而慢性肾脏病纤维化发生的驱动因素可能是自身免疫、氧化应激或炎症[16]。重塑的病理性肾脏纤维化过程经常导致肾脏功能的障碍，并可能与高发病率和高死亡率息息相关[17]。因此调控慢性肾病炎症，预防和缓解纤维化进程可能是改善慢性肾脏病肾脏损伤，避免肾脏不可逆损伤的重要途径。

柴黄益肾颗粒基本功效为益气活血，清热利湿。研究[18]表明，柴黄益肾颗粒可改善肾小球的病理损害，减少蛋白尿，抑制巨噬细胞和淋巴细胞的浸润，下调TGF-β 和Ⅰ型胶原在肾小球的表达。然而，其对慢性肾病间质纤维化的作用还未见报道。本研究采用单侧输尿管结扎（UUO）的方法，建立了肾脏纤维化模型，并予以柴黄益肾颗粒干预，以观察柴黄益肾颗粒对慢性肾病纤维化的改善作用。结果表明，UUO 模型中肾小管损伤和肾脏间质纤维化病变明显，给予低剂量和高剂量柴黄益肾颗粒均能有效缓解肾小管上皮细胞肿胀、坏死和脱落，并降低肾脏间质纤维化程度。此外，纤维化关键指标α-SMA 和Fn 的蛋白水平均在柴黄益肾颗粒干预后明显下调。以上结果证实，柴黄益肾颗粒对慢性肾病肾脏损伤和纤维化具有明显的治疗作用，且高剂量组效果更佳。然而，其潜在的作用机制未明。

肾脏纤维化作为慢性肾病的关键病理变化，其在长期的演变过程中受到多种因素刺激和影响，其中炎症就是慢性肾病肾脏中长期存在并诱导肾脏纤维化的重要因素[19]。为此，本研究采用ELISA法检测柴黄益肾颗粒干预慢性肾病纤维化后肾脏组织中炎症因子的浓度和表达，以及肾脏组织中关键炎症转录因子NF-κB 的活性。结果表明，柴黄益肾颗粒可明显降低UUO 模型小鼠肾脏中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度，下调了这3个炎症因子的mRNA表达水平，从基因表达到蛋白分泌均得到了有效的抑制。同时，Western Blot 结果证实柴黄益肾颗粒可明显抑制炎症关键转录因子NF-κB 蛋白的磷酸化水平，证明了柴黄益肾颗粒明显的炎症抑制作用，从而为肾纤维化的转归提供了稳定的抗炎症环境。

巨噬细胞作为一个关键的免疫炎症响应细胞，在多种疾病中具有促炎症作用。其中巨噬细胞可诱导型C型凝集素Mincle是巨噬细胞上响应炎症刺激因素并激活炎症的关键受体[20]。Mincle 与下游Syk/NF-κB形成炎症响应信号回路，促进了急性肾损伤和慢性肾病的肾脏炎症[13，21]。我们推测，柴黄益肾颗粒可能通过调控巨噬细胞Mincle，下调慢性肾病肾脏炎症，进而改善纤维化的形成。免疫荧光结果表明，Mincle在慢性肾病间质中高表达，柴黄益肾颗粒干预后明显下调了肾脏间质中Mincle 的蛋白水平。Western Blot 结果也证实柴黄益肾颗粒可下调UUO 诱导的Mincle 表达以及Syk磷酸化水平。进一步的流式细胞实验表明，F4/80 阳性的巨噬细胞中Mincle 的表达在柴黄益肾颗粒干预后明显下调，且高剂量组效果较好，说明柴黄益肾颗粒可明显抑制巨噬细胞中的Mincle表达。为深入证明柴黄益肾颗粒是否可通过抑制巨噬细胞Mincle 的表达进而下调炎症改善纤维化，我们采用Mincle的激动剂TDB在体内激活Mincle的表达，观察激活Mincle 后柴黄益肾颗粒抗肾纤维化效果是否降低。病理结果表明，通过TDB 过表达Mincle后，柴黄益肾颗粒改善肾脏损伤和纤维化的作用被明显减弱了，且纤维化相关指标α-SMA和Fn的蛋白水平也在TDB作用后明显上调，Mincle的下游信号Syk/NF-κB活性再度激活，肾脏中炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的浓度也明显增加。这些结果表明，激活的Mincle 表达可减弱柴黄益肾颗粒下调的慢性肾病肾脏炎症和纤维化，证明柴黄益肾颗粒可通过抑制巨噬细胞Mincle 调控的炎症改善慢性肾病肾纤维化。

综上所述，柴黄益肾颗粒能有效改善慢性肾病肾脏纤维化，并减轻炎症反应。其作用机制与下调肾脏巨噬细胞Mincle有关，其下游信号通路Syk/NF-κB的抑制可明显降低慢性肾病炎症以及纤维化的转归。本研究采用了单侧输尿管结扎诱导的肾脏纤维化模型，后续本研究组将采用更多的慢性肾病造模方法，在多种模型上进行验证。本研究有助于了解柴黄益肾颗粒对慢性肾病肾损伤和纤维化治疗的潜在作用机制，为中药干预慢性肾病炎症与纤维化的转归研究拓展思路。