反刍动物瘤胃甲烷生成及调控策略研究进展

滕战伟,齐可喜,陈秋楠,贺永惠,高腾云

(1.河南科技学院 动物科技学院,河南 新乡 453003;2.河南农业大学 动物科技学院,河南 郑州 450046)

温室气体的排放造成全球气候发生极端性变化,深刻影响着人类的生存和发展。习近平总书记在第七十五届联合国大会一般性辩论上提出,我国力争在2030年实现“碳达峰”和2060年实现“碳中和”的目标。碳中和目标不仅针对二氧化碳(CO2),还包含非CO2温室气体,如甲烷(CH4)、氧化亚氮(N2O)等,且非CO2温室气体危害更大。畜牧业是重要的非CO2温室气体排放来源,其面临着高效生产和绿色低碳协调发展的重大挑战。反刍动物生产中产生的CH4是畜牧业温室气体的主要贡献者,约占整个畜牧业CH4排放量的89%[1]。CH4的增温潜力是CO2的25倍[2-3],CH4在大气中的留存时间约为12.2年,CO2在空气中的留存时间约为100年[4],由此可见,CH4减排是一种较为快速的缓解气候变化的方法。反刍动物以CH4形式损失的能量占其总摄入能的8%～14%,降低饲料能量的利用效率[5]。如果每千克标准乳的CH4排放量降低2.5 g,则每千克饲料可多生成300 mL标准乳[6]。因此,减少反刍动物CH4的排放不仅能提升饲料的利用效率,同时可以较快缓解温室效应。

调控反刍动物CH4的生成,提高饲料报酬是近年来科研工作者的研究重点和热点[7]。WALLACE等[8]采用宏基因组技术对高产牛和低产牛的瘤胃微生物进行分析发现,高产牛瘤胃内参与CH4生成途径的基因的相对丰度低于低产牛。XUE等[9]采用宏基因组学和代谢组学研究发现,与高产奶牛组相比,低产奶牛组的古菌和Methanobrevibacter在属水平上有较高丰度,M.millerae在种水平上有较高丰度,这表明低产奶牛组可能会产生更多CH4。上述研究表明CH4的生成或许是导致奶牛泌乳量降低和生产效率低下的原因之一。我们以“瘤胃”和“甲烷减排”的英文翻译的关键词在Web of Science数据库中进行检索,结果显示在2018—2022年中,共有10 108篇相关文章发表,每年文章发表数量较2018年之前大幅增长。使用一个词云来说明这10 108篇论文摘要中出现的高频词,其中最常见的有“反刍动物”“产甲烷菌”、“日粮组成”(图1),这表明反刍动物CH4减排越发受到关注。反刍动物CH4的生成受动物品种、日粮组成和瘤胃微生物群落结构等诸多因素的影响[5],研究清楚反刍动物CH4生成的途径和影响CH4生成的因素有助于制定有效的CH4减排措施。本文从反刍动物瘤胃CH4的生成途径、产甲烷菌的研究进展及调控CH4生成的措施等方面进行综述,以期为反刍动物生产中制定有效的CH4调控措施提供参考。

1 反刍动物瘤胃CH4生成途径

反刍动物CH4主要来自于瘤胃发酵,占反刍动物CH4生成量的80%以上。反刍动物瘤胃内栖息着大量的微生物,主要有细菌、真菌、原虫和古菌等,在这些微生物的协同作用下,反刍动物能够将其采食的饲粮发酵成为机体所需的各种营养物质,在此过程中产生大量的CO2、H2、甲酸、乙酸和甲醇等[4]。反刍动物瘤胃中CH4的生成是瘤胃发酵过程中产生的氢的重要利用途径,主要是产甲烷菌转化的结果,由产甲烷菌生成的CH4占反刍动物CH4生成总量的90%以上[7]。根据CH4生成的前提物不同,可将反刍动物CH4生成途径划分为3种,分别是CO2-H2还原途径(氢营养型路径)、乙酸发酵途径和甲基转化途径,其中氢营养型路径是瘤胃内甲烷生成的主要路径,后两种途径CH4的生成量较少。为更好的解释和定义瘤胃微生物的功能,MORAIS等[10]提出“功能组概念”即根据瘤胃微生物的实际功能特征对其进行分类研究,而不是分类学特征来研究。依据“功能组概念”分析,反刍动物瘤胃内CH4的生成过程至少分为3种不同的功能组:首先,氢营养型功能组产CH4,代谢输入物为H2和CO2;其次,甲基营养型功能组产CH4,代谢输入物为甲基化合物;再次,乙酸发酵型功能组产CH4,代谢输入物是醋酸盐。由此可知,调控反刍动物瘤胃甲烷生成的关键在于促进瘤胃内氢的利用,防止瘤胃内生成的氢被产甲烷菌利用。因此,有必要深入了解反刍动物瘤胃产甲烷菌的菌群组成和多样性特征。

2 反刍动物瘤胃产甲烷菌研究进展

产甲烷菌在CH4的生成中具有重要作用,是一类严格厌氧的原核生物。甲基-辅酶M还原酶(methyl-coenzyme reductase,mcr)是产甲烷菌中特有的一种酶,但甲烷营养型古菌除外,科研工作者通常采用mcrA基因用于产甲烷菌的分类学研究。目前从反刍动物瘤胃内被鉴定出广泛存在的产甲烷菌属主要有甲烷杆菌属、甲烷短菌属、甲烷微菌属和甲烷八叠球菌属等4个菌属。已知甲酸甲烷杆菌、反刍兽甲烷短杆菌、布氏产甲烷杆菌等7个种的产甲烷菌能够在体外培养存活[11]。产甲烷菌合成CH4过程中,特有3种辅酶即辅酶420、辅酶M和因子B参与甲烷的合成。此外,产甲烷菌细胞膜的组成与细菌有所不同,产甲烷菌的细胞壁无胞壁酸,细胞膜的脂质通过类异戊二烯、乙醚与甘油或者碳水化合物相连[12]。

随着分子生物学技术的发展,高通量测序技术被广泛用于瘤胃产甲烷菌的群落结构和功能研究,用于探索产甲烷菌与环境之间的关系,以期找到与调控CH4相关的靶标菌群。GONZALEZ-RECIO等[13]采用荷斯坦牛和瑞士褐牛探究了宿主基因型对牛瘤胃微生物组成的影响,结果表明牛瘤胃中甲烷短杆菌和甲烷球菌与CH4的排放高度相关,对宿主基因型和微生物进行关联性分析发现动物品种显著影响甲烷短杆菌。JEYANATHAN等[14]研究发现在荷斯坦与娟姗杂交奶牛和绵羊的瘤胃内均存在反刍兽甲烷短杆菌、奥氏甲烷短杆菌、戈氏甲烷短杆菌、陶氏甲烷短杆菌和米氏甲烷短杆菌以及Methanosphaera等与CH4生成相关的产甲烷菌,并且是甲烷生成的核心菌群。董利锋等[15]综述表明肉牛瘤胃中甲烷短杆菌属为CH4生成的优势菌群,其组成和多样性不受遗传背景和菌群研究方法的影响。但是,不同肉牛品种间产甲烷菌区系的组成及其相关的代谢通路的差异化机制仍需深入研究。上述研究表明产甲烷的核心菌群或许不因动物种类不同而发生变化,这为进一步区分到底哪些微生物是与CH4产量密切相关的靶标菌群提供了思路。

除甲烷短杆菌属外,瘤胃C簇甲烷菌也能在反刍动物的胃肠道内被检测到,中国牦牛瘤胃内瘤胃C簇甲烷菌所占比例达79.4%,这类甲烷菌主要以甲胺为底物来生成CH4[16-18]。WANG等[19]研究发现随牦牛日龄的增加,牦牛瘤胃内产甲烷菌的区系结构和相对丰度会发生显著改变。在成年牦牛和老年牦牛瘤胃中甲烷短杆菌属和热无胞壁单胞菌(Thermogymnomonas)是这2个生理阶段牦牛瘤胃中的优势菌,但与成年牦牛相比,甲烷短杆菌属在老年牦牛瘤胃中的相对丰度较高,而热无胞壁单胞菌相对较低。由此可以看出,动物生理阶段不同,其瘤胃内甲烷菌的构成也存在差异,但多数研究证实甲烷短杆菌属及其相关的产甲烷菌种为瘤胃中CH4生成的优势菌群,对CH4生成起着主导作用。

值得注意的是,反刍动物瘤胃内不同部位所溶解的CH4浓度和产甲烷菌多样性存在差异,具体表现为背囊部高于腹囊和盲囊部。究其原因是背囊部前段靠近消化道,易混入唾液,混入的唾液升高了该部位的pH值,因此,该部位产甲烷菌的多样性较高[20]。这一研究结果提示科研工作者,在开展反刍动物产甲烷菌试验时为保证试验结果的准确性和试验结果之间的可对比性,采集瘤胃液样品时需要考虑采集位点和采集时间的一致性。

3 调控反刍动物CH4排放的策略

反刍动物CH4的生成受到遗传背景、采食量、采食行为、反刍时间、瘤胃代谢功能和微生物组成等多种因素的影响[5,21]。科研工作者围绕影响CH4生成的因素开展了大量试验,主要有以下几类。日粮组成和饲料品质:饲喂高品质的日粮可以提高动物的生产性能和饲料转化效率;某些日粮可以加强丙酸的生成或者减少乙酸的生成,通过减少CH4合成需要的底物H2来减少CH4的生成;瘤胃调控:通过饲喂添加剂直接或间接的抑制产甲烷菌或者通过去除瘤胃原虫、饲喂微生物等方法减少CH4合成;遗传选育:通过遗传选育或者改善管理模式来提高动物的生产性能,通过提高饲料的利用效率来减少每单位产物(肉或奶)的CH4产量;集成措施:在生产上为达到更好的应用效果,根据动物及日粮的不同采用综合型的技术措施来实施CH4的减排。

3.1 日粮组成调控瘤胃CH4生成反刍动物日粮精饲料和粗饲料的比例影响CH4生成。当日粮中精饲料的比例超过80%时,饲粮总能的3%～4%转化成CH4能,若饲粮全部为粗饲料时,超过10%的饲粮总能转化成甲烷能[22]。提升日粮中精料水平能够使甲烷的排放量减少10%～30%。KUMAR等[23]研究表明提高反刍动物日粮中的精料比例,其瘤胃内的丙酸浓度升高,CH4产量降低。这是因为精饲料的增多使瘤胃pH值降低,进而导致原虫数量减少,由于产甲烷菌附着于原虫上,所以产甲烷菌数量也随之减少,从而减少CH4的生成。LI等[24]最新研究表明高纤维饲粮通过富集以产琥珀酸丝状杆菌为代表的纤维分解菌群,提高纤维利用率和乙酸产量,促进了甲烷菌增殖和CH4生成;高淀粉饲粮则通过富集以嗜淀粉瘤胃杆菌为代表的淀粉降解菌群和以埃氏巨球形菌为代表的乳酸利用菌群,进一步激活以乳酸为中间产物的丙烯酸酯途径,从而促进丙酸生成,这有助于反刍动物在高淀粉日粮条件下维持瘤胃健康。高淀粉饲粮显著增强瘤胃发酵能力,通过抑制甲烷菌增殖减少CH4生成。在现代集约化养殖过程中,大量使用高精料饲粮来提升反刍动物的生产性能,但精饲料饲喂过多不仅增加饲养成本,而且容易导致反刍动物瘤胃酸中毒。有研究指出,当反刍动物瘤胃内发酵生成的乙酸和丙酸的比值为0.5时,丙酸的生成能够完全利用乙酸发酵产生的H2,减少生成CH4所需的底物H2,因此,机体不生成或者仅少量生成CH4[23]。理想的消耗H2的途径是将瘤胃发酵产生的H2转化为VFA等可以为动物提供能量的物质。今后,在不影响反刍动物正常生产的前提下,可以尝试通过调整日粮组成找到一个精饲料和粗饲料搭配比例的平衡点使瘤胃发酵过程中产生的乙酸和丙酸的比值尽可能接近0.5,来减少CH4的生成。

我国蛋白质类饲料资源的严重匮乏已成为制约我国畜牧业的瓶颈问题,严重阻碍了我国畜牧业的发展。在不影响畜禽生产性能的前提下,采用低蛋白饲粮技术是当下解决此类问题的有效途径。CH4虽来源于碳水化合物,但饲粮蛋白水平同样能影响甲烷排放。WARNER等[25]试验发现,与饲喂粗蛋白质含量高的饲草相比,饲喂粗蛋白质含量极低的饲草CH4产量下降8%。KIGGUNDU等[26]研究发现,当短角泽布牛采食含110 g/kg蛋白质饲粮时比130 g/kg蛋白质饲粮的甲烷排放量降低30.7%。因此,降低反刍动物饲粮蛋白质水平,可有效减少CH4的排放。反刍动物的瘤胃是一个复杂的微生态系统,饲粮蛋白质水平与瘤胃中微生物的关系十分复杂,瘤胃微生物在蛋白质利用和CH4生成方面具有重要作用,科研工作者对它们之间的相关关系的认知仍然有限。今后需要进一步探究饲粮蛋白和能量水平与反刍动物瘤胃微生物的相关关系,在保证饲料养分满足反刍动物需求且不影响生产性能的前提下,通过调节饲粮蛋白水平来调控相关微生物的数量或活性来调控CH4的生成,为低蛋白饲粮在反刍动物生产中的应用提供理论基础。

3.2 添加剂调节瘤胃CH4生成反刍动物日粮中添加油脂类物质可降低CH4的排放量[27]。日粮中添加1%～3%的油脂能减少10%～25% CH4的生成量,最高可达40%[28]。POULSEN等[18]研究表明,奶牛日粮添加菜籽油可显著抑制CH4的生成,采用宏转录组技术对奶牛的瘤胃液进一步分析发现,菜籽油的添加降低了瘤胃中甲基营养性产甲烷菌热原体纲和mcrA基因的表达量。宿主基因型、瘤胃微生物和日粮组成三者之间存在复杂的交互作用,那么油脂类减少CH4的排放是否受到宿主基因型的影响呢?VAN GASTELEN等[29]选用基因型DGAT1 KK和DGAT1 AA各半的产奶牛研究日粮中添加亚麻籽油对CH4排放的影响以及亚麻籽油与DGAT1基因的交互作用,结果表明:亚麻籽油通过降低瘤胃内乙酸比例、乙酸/丙酸比值以及古菌在总菌中的比例,来减少CH4产量。此外,DGAT1基因对CH4的产量和产生通路未产生显著影响,亚麻籽油减少CH4的排放不依赖于DGAT1基因。不同来源的油脂会影响家畜的采食量,从而影响甲烷的减排效果。脂肪酸钙和硬脂酸等瘤胃惰性脂肪通常不会影响家畜的采食量,而使用油料种子(菜籽和大豆等)的日粮中粗脂肪含量增加1%会导致采食量降低(0.90±0.52)kg[6]。此外,脂类能够与单宁酸协同减少CH4的生成,并且发现单宁对CH4的减排效率低于莫能菌素[30]。综上所述,脂类抑制CH4减排的主要原因如下,一是脂类使不饱和脂肪酸发生氢化,减少CH4合成的底物H2;二是脂类可以直接抑制产甲烷菌生长或者通过抑制原虫的生长来间接抑制产甲烷菌的生长,从而减少CH4的生成。需要注意的是,日粮中添加脂类会对动物的干物质采食量以及饲料的消化率产生一定的负面影响,这是今后要解决的问题。

3-硝基氧基丙醇(3-NOP)是一种新型的CH4抑制剂,近年来受到科研和生产领域的广泛关注。MELGAR等[31]在荷斯坦奶牛饲粮中添加60 mg/kg的3-NOP,持续饲喂15周,结果表明,3-NOP降低奶牛CH4排放量和排放强度可达27%～29%,同时对采食量、产奶量和饲料消化率未产生不利影响。3-NOP抑制CH4排放的效果受到家畜种类、日粮组成和添加剂量的影响。DIJKSTRA等[32]指出3-NOP对CH4的抑制作用在奶牛上强于肉牛,在奶牛饲粮中添加3-NOP(81 mg/kg DM)的减排效果与肉牛(144 mg/kg DM)相似。上述研究表明较低剂量的3-NOP便可以抑制CH4生成,这可能是因为3-NOP的化学结构和甲基辅酶M高度相似,并且能使甲基辅酶M还原酶失去活性。虽然3-NOP具有良好的应用前景,但3-NOP在动物体内的残留问题和安全问题还需要进一步探究。

3.3 调控瘤胃氢利用相关的微生物调节CH4生成原虫占据瘤胃生物的50%以上,是瘤胃内主要的产H2微生物。产甲烷菌吸附在原虫表面,可快速利用原虫产生的H2生成CH4,那么,驱除瘤胃内的原虫能否有效减少CH4的生成。李宗军[33]基于META分析的方法研究了驱除原虫对CH4排放的影响,结果发现,短期驱除原虫(小于10周)可以显著的减少CH4的排放,而长期驱除原虫(大于10周)结果与之相反,CH4产量反而上升。有趣的是,短期驱除原虫能够显著提升瘤胃中丙酸含量,乙酸和丁酸含量显著降低;长期驱除原虫时,瘤胃内乙酸含量显著升高,丙酸和丁酸含量无显著变化。该研究表明随着驱除原虫时间的延长CH4的产量呈现先降低再升高的趋势,这与瘤胃内乙酸和丙酸比值先降低再升高相关。日前,科研工作者公布了世界上首个瘤胃原虫的基因组目录,厘清了其系统发育关系和分类学框架,鉴定出3 000多个非冗余的碳水化合物活性酶(CAZymes),发现原虫是一类可媲美肠道真菌的降解微生物且纤毛虫酶在生物质转化方面有巨大应用潜力[34]。由此可以看出,短期驱除反刍动物瘤胃内原虫可以减少CH4的生成,但长期驱除原虫不利于瘤胃内碳水化合物代谢对机体的能量供应。

随着我国饲料中全面禁抗政策的发布,寻找安全、高效的抗生素替代品亟待研究。饲喂微生物以不会产生药物残留的优势成为科研工作者的研究热点。产乙酸菌是一种厌氧氢利用菌,在动物体内产乙酸菌通过还原性乙酰辅酶A或Wood-Ljungdahl通路将H2和CO2还原成为乙酸重新被动物吸收利用,提高了日粮能量的转化效率并减少CH4生成,是CH4减排的一种生物学途径[35]。成年反刍动物的瘤胃微生物产生氢气的量远低于新生反刍动物瘤胃微生物组的产量,同时随着日龄的增加,新生动物瘤胃中的产乙酸功能组的丰度也随之降低[36]。这表明产乙酸功能组在低氢的环境下处于劣势,产乙酸菌竞争氢的能力小于产甲烷菌。杨春蕾[37]在抑制产甲烷菌的基础上研究添加产乙酸菌对CH4生成的影响,结果表明单独添加产乙酸菌或者在抑制产CH4的基础上添加产乙酸菌均未显著降低CH4的排放,该结果可能与产乙酸菌的来源有一定关系。今后可以通过研究不同来源的产乙酸菌对瘤胃CH4生成的影响,全面研究强化瘤胃乙酸生成途径降低甲烷的可行性;或通过基因重组的方法对产乙酸菌的氢代谢相关的基因进行改造,提升产乙酸菌的氢利用能力,使其能够与产甲烷菌高效的竞争。

生物技术的快速发展为CH4的生成调控提供了新的思路。辅酶F420是产甲烷古菌生成CH4的重要辅酶,CofD酶是辅酶F420生物合成中重要的作用酶。周婷[38]通过基因敲除的方法将反刍兽甲烷短杆菌CofD基因进行敲除,结果表明,CofD基因敲除降低了CofD酶和辅酶F420的表达量以及甲烷短杆菌的繁殖能力,从而降低生成CH4的能力。

3.4 其他调控CH4生成的措施改善牧场的管理方式也是降低牧场整体水平CH4排放量的一种措施。对放牧动物而言,提高草地质量可以提高日粮消化率并有助于减少CH4排放,这与草料的成熟度能够影响饲料的营养密度和消化率相关。但是,若放牧率增加时,CH4的排放量也会增加[28]。此外,畜牧养殖过程中产生的大量粪便也是温室气体主要的来源之一,同时也是种植业有机肥原料的主要来源之一。今后可将畜牧业粪污温室气体减排和种植业紧密的结合起来,也是未来畜牧业CH4减排的重要研究方向。

反刍动物产生CH4的性状是可以遗传的。与人类相比,奶牛的可遗传微生物是人类的10倍,奶牛瘤胃内的核心微生物对奶牛的产奶量、乳品质量和CH4排放起主要作用,甚至比奶牛本身基因起到更重要的作用,这表明牛与其瘤胃微生物之间存在更深层次的相互关系[39]。JONKER等[40]通过研究低CH4产率和高产率的羊只在不同饲粮和季节下研究发现,动物CH4产率遗传形状的表达和环境无关,同时动物遗传因素对CH4产率的影响不随饲粮变化而变化。宿主基因型和瘤胃微生物共同影响反刍动物的CH4排放,并鉴定到与CH4生成相关的靶向微生物,这为后续精准调控CH4生成指明了方向[41-42]。CH4调控最大的挑战在于反刍动物瘤胃内的微生物可能会产生适应性和耐受性,从而使多种调控方法只能起到短暂的作用。因此,只有清楚认知哪些微生物菌群在纤维消化方面具有重要作用且不需要大量的产甲烷菌群的协助,才能够在提升饲料消化率或不影响饲料消化率的情况下减少CH4的生成,从而提升反刍动物能量的利用效率。目前,对反刍动物瘤胃微生物的研究还远远不够。MORAIS等[10]提出通过使用“功能组概念”对瘤胃微生物进行分类研究以解决由于水平基因转移事件或功能冗余而造成的分类紊乱,从而更好的解析瘤胃中微生物的代谢途径。此外,对瘤胃微生物呈现的解析仍需大量的工作,虽然对瘤胃细菌、古菌和原虫的研究取得了一些进展,但仍需要建立培养方法在实验室进行研究[34,43],使反刍动物微生物功能的研究从描述性慢慢的向机制性转变,构建瘤胃微生物的功能性和生态性网络,从而通过网络调控反刍动物CH4减排并提高其生产效率。因此,在不完全清楚反刍动物瘤胃生态系统中各微生物组的功能的情况下,通过遗传手段来降低CH4排放有可能会对反刍动物的消化功能产生不利的影响。

综上所述,从研究角度来看,对CH4减排的单项措施进行研究是必要的。但从应用角度考虑,想要达到较为理想的减排效果,必须根据动物和日粮的不同采用系统集成型的综合技术措施。研究表明,基因组选育、营养调控和调控瘤胃生态结构等调控CH4生成的方法,其降低CH4的最大潜力均不超过20%;若将上述方法进行集成组合,采用集成型的措施降低CH4的最大潜力可以提高到30%[21]。李宗军[33]以奶山羊为试验动物,利用硝酸酯构建高氢分压模型,同时采用延胡索酸作为氢受体研究两者对瘤胃代谢的影响,结果表明硝酸酯和延胡索酸都可持续的抑制奶山羊CH4的排放。目前,反刍动物CH4减排的研究越来越多,但集成型的研究尚不完全,许多调控措施在CH4减排的效果和使用剂量上存在分歧。未来需要将更加合理的研究方法和手段来进行集成,以期达到CH4减排的目的。总之,反刍动物的CH4减排是一个复杂的工程,只有多策并举才能实现实质性的突破,从而实现畜牧业低碳、可持续的发展,进而缓解农业对全球气候变暖的影响。

4 小结

减少反刍动物CH4排放有助于缓解温室效应并提高饲粮利用效率。调控瘤胃CH4生成的关键在于促进瘤胃内氢的利用并防止瘤胃内生成的氢被产甲烷菌利用生成CH4。反刍动物CH4调控最大的挑战在于其瘤胃内的微生物会产生适应性和耐受性,从而导致多种调控CH4生成的方式存在一定的时效性。今后需要建立培养方法在实验室进行研究,使反刍动物微生物功能的研究从描述性慢慢的向机制性转变,构建瘤胃微生物的功能性和生态性网络,从而通过网络调控CH4减排和提高生产效率。针对我国蛋白质类饲料和优质粗饲料资源严重匮乏的现状,可在保证饲料养分满足反刍动物需求且不影响生产性能的前提下,通过开发低蛋白饲喂技术和改善粗饲料品质来减少CH4排放。目前,我国采用生命周期评价温室气体时所才用的相关系数并不完全符合我国的实际情况,仍需要进一步研究,尽快建立我国的畜牧养殖数据库,从而系统的评估温室气体排放量,为我国温室气体的减排提供科学支持。