牛磺酸对高温条件下奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响

吕雨杰,贾 晗,梁 亮,罗宗刚,2,蒙 灿,刘菲菲,张龚伟,2,左福元,2,王 玲,2*

(1.西南大学 动物科学技术学院,重庆 荣昌402460;2.重庆市肉牛工程研究中心,重庆 荣昌,402460)

在现代畜牧业发展中,奶牛养殖最容易受到全球变暖和气候变化的影响[1]。高温条件下,奶牛会出现热应激反应,不仅会使其采食量下降、牛奶产量降低,还会损害奶牛的健康[2-3]。热应激作为一种主要的环境应激源,给奶牛业带来了巨大挑战。乳腺上皮细胞是参与奶牛泌乳中最重要的一种细胞,产奶量可随着泌乳高峰期后乳腺组织中上皮细胞数量的减少而减少。在高温环境条件下,乳腺上皮细胞会发生凋亡,这种凋亡与产奶量的下降密切相关[4-5]。

牛磺酸(taurine,Tau)是一种β-氨基乙磺酸,以游离状态存在于动物组织中,具有抗细胞凋亡和许多药理功能[6-7]。YANG等[8]研究发现,牛磺酸可以抑制由内质网应激介导的细胞凋亡以及细胞基质的过度降解来保护髓核细胞。SUN等[9]研究结果显示,牛磺酸通过激活PI3K/AKT信号通路减轻大鼠由丙烯酰胺引起的细胞凋亡。在热应激状态下,牛磺酸具有提高家禽的热应激适应性、抗炎、抗氧化及改善生产性能等功能[10]。MA等[11]研究表明,在热应激条件下,肉鸡饲料中补充牛磺酸,可以显著抑制PERK信号传导和逆转内质网诱导的细胞凋亡和蛋白质分解,从而改善慢性热应激引起的肉鸡肌肉损失和肌肉质量下降。牛磺酸是否能缓解热应激引起的奶牛乳腺上皮细胞的凋亡目前报道很少,本试验在高温条件下不同浓度牛磺酸对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响,为探究牛磺酸对奶牛热应激调控的分子机理以及缓解奶牛热应激、维持奶牛乳腺泌乳能力提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂实验室利用荷斯坦牛分离培养的奶牛乳腺上皮细胞;胎牛血清、DMEM/F12完全培养基购自Gibco公司;牛磺酸(Taurine,纯度>99%)购自麦克林公司;D2000 DNA Marker、Total RNA Extraction Kit、琼脂糖购自北京索莱宝科技有限公司;SuperReal 彩色荧光定量预混试剂盒购自天根生化科技有限公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)、Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit购自碧云天公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(反转录试剂盒)购自TaKaRa公司。

1.2 细胞培养及处理将奶牛乳腺上皮细胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基中,在37℃、5% CO2培养箱中培养后细胞分别接种于12孔板、24孔板和96孔板,当细胞密度为60%～70%时更换为含0,8,32,128,256 mmol/L牛磺酸的培养基于37℃培养6 h后转移至42℃培养6 h,其中0 mmol/L 处理组为对照组,每个处理设置4个重复。

1.3 细胞增殖检测按照CCK8检测试剂盒说明书进行奶牛乳腺上皮细胞活力及增殖水平检测。在高温处理后的96孔板的细胞中,每孔加入10 μL的CCK-8溶液,在37℃培养箱中孵育1 h,用酶标仪测定D450 nm值。

1.4 细胞凋亡检测使用Annexin V-FITC试剂盒对细胞进行凋亡检测:取出添加牛磺酸高温处理后的24孔细胞培养板,弃掉细胞培养基, PBS洗涤后加入195 μL Annexin V-FITC结合液;加入5 μL Annexin V-FITC,轻轻混匀;加入10 μL碘化丙啶染色液,轻轻混匀;室温避光孵育15 min后进行冰浴,随即在荧光显微镜下观察,Annexin V-FITC为绿色荧光,碘化丙啶(PI)为红色荧光。

1.5 实时荧光定量PCR

1.5.1引物设计与合成 根据GenBank中牛的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2基因及内参基因β-Actin的mRNA序列,利用Primer Premier 5.0软件设计实时荧光定量PCR的上、下游引物,引物由金唯智生物科技有限公司合成,基因引物信息见表1。

表1 引物详细信息表

1.5.2总RNA提取与cDNA的合成 使用总RNA提取试剂盒对奶牛乳腺上皮细胞总RNA进行抽提,按反转录试剂盒的操作说明合成cDNA。

1.5.3实时荧光定量PCR 采用SYBR®Green Ⅰ染料法,参照荧光定量试剂盒说明书进行荧光定量PCR,检测细胞中凋亡相关基因mRNA的表达量。反应体系为:cDNA 1 μL,上、下游引物各0.4 μL,2×SuperReal Color PreMix 5 μL,ddH2O 3.2 μL。荧光定量PCR的反应程序:95℃预变性 30 s;95℃变性10 s,60℃退火30 s,共39个循环,随后进行熔解曲线分析。

1.6 数据统计分析细胞增殖使用以下公式计算:细胞活力=[D处理-D空白]/[D对照-D空白]×100%;荧光定量PCR结果采用2-ΔΔCt法进行分析,通过IBM SPSS 24.0软件进行单因素方差分析,用“平均数±标准差”对细胞增殖及荧光定量PCR结果进行差异性分析,用Graphpad Prism 8.0作图,P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 牛磺酸对高温条件下奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响利用CCK-8试剂盒检测奶牛乳腺上皮细胞的增殖情况,从图1可以看出,在高温条件下,8,32,128 mmol/L牛磺酸处理组的奶牛乳腺上皮细胞活力显著高于对照组(P<0.05),其中添加32 mmol/L牛磺酸对奶牛乳腺上皮细胞增殖最为显著(P<0.05);在高温条件下,256 mmol/L牛磺酸处理组和对照组相比乳腺上皮细胞活力显著降低(P<0.05)。

不同小写字母间表示差异显著(P<0.05);相同小写字母间表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.2 牛磺酸对高温条件下奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响利用细胞凋亡检测试剂盒对高温条件下牛磺酸处理的奶牛乳腺上皮细胞进行凋亡检测,结果显示,在高温条件下,与对照组相比,8,32 mmol/L处理组的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的数量呈下降趋势,呈现坏死的细胞数量变化不明显;添加128,256 mmol/L牛磺酸处理组的凋亡细胞的数量与对照组相比显著增加,256 mmol/L的牛磺酸抑制了细胞的增殖,细胞数量明显减少,凋亡和坏死的细胞显著增加,说明高浓度牛磺酸处理会促进奶牛乳腺上皮细胞凋亡(图2)。

绿色荧光为凋亡细胞,绿色和红色荧光双染的为坏死细胞,未被荧光染色的为正常细胞

2.3 奶牛乳腺上皮细胞凋亡相关基因mRNA表达不同浓度牛磺酸对高温条件下奶牛乳腺上皮细胞凋亡相关基因mRNA表达量见图3。从图中可以看出,高温条件下,奶牛乳腺上皮细胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax基因的表达量随牛磺酸浓度的增加呈现先降低后升高的趋势。其中,Caspase-3基因表达量在32,128,256 mmol/L处理组与对照组出现显著性差异(P<0.05),在32 mmol/L处理组表达量最低;Caspase-8基因表达量在0～128 mmol/L处理组间差异不显著(P>0.05),256 mmol/L处理组较对照组显著升高(P<0.05);Caspase-9基因在8,32,256 mmol/L处理组的表达量与对照组差异显著(P<0.05);Bax基因表达量在各处理组和对照组差异显著(P<0.05),8,32,128 mmol/L处理组间基因表达差异不显著(P>0.05);抗凋亡基因Bcl-2表达量随牛磺酸浓度的增加呈现先上升后下降的趋势,在32 mmol/L处理组的表达量显著高于其他处理组(P<0.05);Bax/Bcl-2基因表达量比值在8,32,128 mmol/L处理组与对照组相比显著降低(P<0.05),256 mmol/L处理组的比值较对照组显著升高(P<0.05)。

图3 牛磺酸对高温条件下奶牛乳腺上皮细胞凋亡相关基因表达量的影响

3 讨论

在高温条件下,当动物总的热负荷超过了它的散热能力,就会出现热应激状态,从而产生一系列生理和行为反应以减少机体压力。由环境引起的热应激导致动物生产性能下降,给全球畜牧业带来巨大的经济损失。动物调节体温的能力与物种及品种有关,奶牛通常比肉牛品种对热更敏感,更容易受到热应激的影响[12]。高温引起的热应激在一定程度上会扰乱细胞内自由基的稳定,导致细胞和线粒体氧化损伤[13]。作为参与乳汁合成过程中最重要的泌乳细胞,即乳腺上皮细胞,其质量和数量在一定程度上决定奶牛的产奶量,并在乳腺发育和泌乳过程中不断增殖和分化[14]。

牛磺酸在动物的脑、心脏、肝脏、肾脏及骨骼肌中表达丰富,在维持细胞稳态、应激反应、抗氧化、能量代谢等方面具有重要作用[15-16]。本试验发现,奶牛乳腺上皮细胞在高温条件下,添加8,32 mmol/L的牛磺酸能够提高细胞活力,促进细胞增殖,减少细胞凋亡水平,说明牛磺酸能有效缓解高温环境诱导的细胞凋亡。大量研究表明,牛磺酸可以作为抗氧化剂和营养补充剂,具有保护细胞膜和抗炎的功能,有效减轻哺乳动物细胞炎症、内质网应激和细胞凋亡,在将应激所引起各种疾病严重程度最小化方面发挥着重要作用[17-18]。

热应激具有细胞毒性,可引起活性氧(ROS)和活性氮自由基的产生,导致氧化损伤。为应对来自内部和外部环境的有害刺激,机体通过调节代谢反应,激活凋亡通路以维持细胞稳定[19]。研究发现,牛磺酸可通过减少ROS的形成和减少凋亡相关蛋白的表达来防止高糖诱导的细胞凋亡[20]。本试验中RT-PCR结果显示,添加不同浓度的牛磺酸使高温条件下的奶牛乳腺上皮细胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Bax基因mRNA表达量呈现先降低后上升的趋势,Bcl-2基因mRNA表达量呈先上升后下降的趋势。Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9是Caspase家族的重要成员,在凋亡信号通路和其他生物学功能扮演着关键角色。Caspase-3是效应型Caspases,是凋亡的执行者,负责细胞凋亡的形态和生化特征改变。Caspase-8、Caspase-9是启动型Caspases,细胞凋亡是否启动受Caspase-8、Caspase-9的酶原是否激活而调控。启动型Caspases通过与凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)相互作用被激活,从而激活效应型Caspases[21-23]。本试验中添加32 mmol/L牛磺酸降低了乳腺上皮细胞Caspase-3、Caspase-9基因的表达,表明高温条件下牛磺酸抑制了乳腺上皮细胞内源性凋亡基因Caspase-9的表达,从而使效应型Caspase-3不能被激活,减少了高温引起的细胞凋亡。

在细胞凋亡过程中,促凋亡基因Bax和抑凋亡基因Bcl-2是Bcl-2家族中最重要的一对相互对立的基因,且Bax可激活Bcl-2的活性,Bcl-2家族基因在接收凋亡信号后,Bcl-2与Bax在体内结合为二聚体,Bax/Bcl-2比值决定着细胞凋亡的走向[24]。高温条件下奶牛乳腺上皮细胞中添加8,32,128 mmol/L牛磺酸Bax基因表达显著下调,32 mmol/L 组中Bcl-2基因表达量显著上调,8,32,128 mmol/L处理组中Bax/Bcl-2比值显著降低,证明牛磺酸促进了抗凋亡基因Bcl-2的表达,抑制了凋亡基因Bax的表达,从而有效抑制由高温引起的乳腺上皮细胞凋亡。研究发现,Bcl-2通过Caspase-9和Caspase-3依赖性途径调节细胞凋亡,上调Bax和下调Bcl-2的表达刺激线粒体释放细胞色素c,细胞色素c与Apaf-1、ATP和ProCaspase-9相互作用组装出细胞凋亡体,激活Caspase-9的表达,从而使Caspase-3活化,最终导致细胞凋亡[25]。本试验中,高温条件下添加256 mmol/L牛磺酸导致凋亡相关基因表达显著升高,大量乳腺上皮细胞死亡,细胞数量减少。BAI等[26]研究结果显示,当细胞中牛磺酸浓度达到200 mmol/L左右时,细胞凋亡增加,本试验的结果与此一致,其可能的原因是过多的牛磺酸会产生毒性,导致细胞凋亡甚至进一步坏死。

综上所述,一定浓度的牛磺酸可以通过影响奶牛乳腺上皮细胞凋亡途径中的相关基因参与高温诱导引发的细胞凋亡的调控过程,有效缓解由于高温环境所引起的奶牛乳腺上皮细胞损伤,从而抵抗细胞增殖受阻和细胞凋亡。牛磺酸可以通过降低细胞凋亡率保护乳腺上皮细胞,以维持乳腺合成和储存乳汁的能力。