红景天苷对1-甲基-4-苯基-1-2-3-6-四氢吡啶诱导帕金森病小鼠的作用及机制

孙梓旭, 董 霞, 赵宝民, 贾海丽, 马晓瑞, 谷 伟

(河北北方学院附属第一医院 全科医学科, 河北 张家口, 075000)

帕金森病(PD)是临床常见的神经退行性疾病之一[1], 患者会出现运动障碍,包括运动迟缓、静息性震颤、肌肉僵直、步态受损和神经精神障碍等[2]。近年来, PD的临床治疗技术有所进步,但目前仍无法有效减缓PD进展,因此迫切需要开发能改善PD且具有神经保护作用的药物。α-突触核蛋白(α-syn)积累成丝状聚集物是PD进展的标志[3],激活核因子E2相关因子2(Nrf2)可以抑制α-syn的过度积累[4]。Nrf2-抗氧化反应元件(ARE)信号通路是一种受氧化还原信号调节的重要抗氧化通路,醌氧化还原酶1(NQO1)是Nrf2-ARE信号通路激活的重要标志,可作为检测ARE激活的指标。Nrf2-ARE通路的激活在调控氧化应激、维持线粒体功能、抑制多巴胺能神经元铁死亡及恢复神经元功能等方面发挥重要作用[5], 近年来已逐渐成为PD研究的热点。红景天苷是从传统中药红景天中提取出的主要生物活性化合物之一,具有广泛的药理作用,如抗炎、抗氧化、抗抑郁、抗辐射、抗癌和心脏保护等作用[6]。研究[7]表明,红景天苷可能通过调节线粒体功能发挥神经保护剂作用,但具体的神经保护作用及其潜在机制尚未阐明。本研究探讨红景天苷对1-甲基-4-苯基-1-2-3-6-四氢吡啶(MPTP)诱导PD小鼠的作用及机制,以期为红景天苷治疗PD提供参考依据,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SN4741细胞(小鼠多巴胺能神经细胞)购自中科院上海细胞库; DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶消化液购自美国HyClone公司; 青链霉素混合液、4%多聚甲醛购自北京碧云天有限公司。

1.2 PD动物模型建立和干预

8周龄雄性C57BL/6小鼠,体质量22～25 g, 由北京中科实验动物有限公司供应,在标准实验动物设施环境(25 ℃, 12 h光照与黑暗交替循环)中饲养7 d, 自由取食和饮水。将40只雄性小鼠随机分为4组,即对照组、MPTP组、MPTP+红景天苷(30 mg/kg)组、MPTP+红景天苷(60 mg/kg)组,每组10只。MPTP组小鼠腹腔注射MPTP(30 mg/kg, 溶于生理盐水),对照组小鼠注射等量生理盐水, MPTP+红景天苷(30 mg/kg)组、MPTP+红景天苷(60 mg/kg)组小鼠在腹腔注射MPTP的基础上每日分别灌胃红景天苷30、60 mg/kg。行为测试后,处死小鼠取脑组织进行后续实验。

1.3 旷场实验

将小鼠放置于白色方形竞技场(45 cm×45 cm×60 cm), 通过竞技场上方的摄像机(SR-XZ301, 日本索尼公司)连续记录小鼠在竞技场中3 min的行为,主要监测运动轨迹、距离、平均速度。采用ANYMaze动物行为分析系统(美国Stoeling公司)对小鼠轨迹进行分析。

1.4 PD细胞模型和干预

SN4741细胞购自中国科学院细胞库,置于含10%FBS、青霉素(100 IU/mL)和链霉素(100 μg/mL)的DMEM培养基中,于37 ℃含5%二氧化碳的加湿培养箱中培养, 2～3 d更换1次培养基。将SN4741细胞按照2×105个/孔密度接种于6孔板中,分为对照组、MPTP+红景天苷(10 μmol/L)组、MPTP+红景天苷(50 μmol/L)组和MPTP组,其中对照组细胞以磷酸盐缓冲液(PBS)处理, MPTP+红景天苷(10 μmol/L)组、MPTP+红景天苷(50 μmol/L)组细胞分别与红景天苷(10、50 μmol/L)孵育2 h, 然后用MPTP(500 μmol/L)刺激24 h, MPTP组仅用MPTP(500 μmol/L)刺激24 h。处理结束后,收集各组细胞进行后续实验研究。

1.5 细胞转染实验

SN4741细胞置于含10%FBS和1%青链霉素混合液的高糖DMEM培养基中,于37 ℃、5%CO2孵箱中培养。次日,将对数生长期的SN4741细胞以1×105个/孔密度接种于6孔板,待细胞贴壁后采用无血清培养基培养,用HighGene转染试剂按照说明书要求分别转染si-NC和si-Nrf2以及si-NC和si-NQO1, 8 h后换液, 24 h后采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中Nrf2表达水平。

1.6 qRT-PCR检测方法

根据试剂盒说明书,使用TRIzol®试剂盒(赛默飞世尔科技公司)从SN4741细胞中提取总RNA, 再用PrimeScript RT Master Mix试剂盒(Takara公司)将总RNA反转录为cDNA, 反转录条件为37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s。使用FastStart Universal SYBR Master Mix试剂盒进行40个循环的PCR扩增,扩增条件为95 ℃ 5 min, 95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s。以GAPDH为内参基因,采用2-△△Ct法分析目的基因相对表达量。si-Nrf2的干扰序列: 5′-AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA-3′; si-NQO1的干扰序列: 5′-GGACAUATTTUGACTTTACGA-3′。

1.7 免疫组织化学法

向小鼠灌注4%多聚甲醛,取出大脑组织于4%多聚甲醛中固定48 h, 然后包埋于石蜡中,切成5 μm厚的切片。切片用二甲苯脱蜡,分级乙醇水合,柠檬酸钠缓冲液中进行抗原修复。每个样本用5%山羊血清封闭30 min, 孵育一抗酪氨酸羟化酶(TH)(Abcam公司,ab137869, 1∶500)、α-syn(Abcam公司, ab214316, 1∶500)、Nrf2(Abcam公司,ab62352, 1∶200)和NQO1(Abcam公司,ab28947, 1∶500), 4 ℃孵育过夜。次日切片洗净,用山羊抗兔IgG二抗孵育30 min。将切片用3-3-二氨基联苯胺(DAB)染色,用苏木精反染色,脱水和干燥后,用中性树胶固定,使用倒置荧光显微镜(型号Ts2R, 日本尼康公司)拍照。免疫组织化学法染色结果的评估标准: 细胞质中出现棕色或棕黄色颗粒的细胞,或染色>25%的细胞为阳性细胞。采用平均阳性染色面积百分比法分析免疫组织化学法染色结果,实验重复3次。

1.8 TUNEL实验

将SN4741细胞置于共聚焦培养皿中,处理后,将细胞用4%多聚甲醛固定15 min, 用0.1% Triton X-100渗透15 min, 用TUNEL检测缓冲液于27 ℃避光孵育1 h。用冰PBS(pH值7.4)洗涤后,将细胞用DAPI染色,使用激光共聚焦显微镜(日本尼康公司)观察。

1.9 免疫荧光实验

采用免疫荧光法检测SN4741细胞中TH、α-syn、Nrf2和NQO1的表达。将细胞用4%多聚甲醛固定30 min, 用PBS洗涤3次(5 min/次)。用0.3% Triton X100处理细胞15 min, 用5%牛血清白蛋白封闭细胞2 h, 孵育一抗TH(1∶500)、α-syn(1∶500)、Nrf2(1∶200)、NQO1(1∶500), 4 ℃孵育过夜。用PBS洗涤后,细胞与荧光偶联抗体(1∶400)在室温下孵育2 h。用PBS洗涤3次(5 min/次),然后用二氨基-2-苯林多尔(DAPI)洗涤5 min, 使用倒置荧光显微镜观察细胞。

1.10 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素(IL)-1β、IL-18表达

IL-1β、IL-18的ELISA试剂盒(ml043627、ml043547)购自上海酶联生物科技有限公司。通过双抗体夹心ELISA法检测脑组织提取液和细胞培养液中IL-1β、IL-18蛋白表达水平,实验步骤严格按照说明书进行。检测各组样本的450 nm处光密度(OD450 nm)值,根据标准曲线获得各组样本的IL-1β、IL-18表达量,同时设置空白对照孔。

1.11 统计学分析

所有数据以Graph PadPrism 7.0软件进行分析,2组间比较采用t检验,多组间比较采用F检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠旷场实验结果

旷场实验结果显示, MPTP组小鼠对场地中心的探索少于对照组, MPTP+红景天苷(60 mg/kg)组小鼠的探索少于对照组但多于MPTP组,差异有统计学意义(P<0.05), 见图1A; MPTP组小鼠3 min活动总距离和平均速度短于或低于对照组, MPTP+红景天苷(40 mg/kg)组、MPTP+红景天苷(60 mg/kg)组小鼠3 min活动总距离和平均速度均长于或高于MPTP组,但仍短于或低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05), 见图1B、图1C。

A: 旷场实验活动轨迹图; B、C: 旷场内3 min总距离、平均速度(与对照组比较, ∗P<0.05; 与MPTP组比较, #P<0.05)。图1 各组小鼠的旷场实验结果

2.2 红景天苷对MPTP诱导PD小鼠TH、α-syn、Nrf2、NQO1、IL-1β、IL-18表达的影响

免疫组织化学法和ELISA检测结果显示,与对照组相比, MPTP组小鼠脑组织TH、Nrf2、ARE表达减少,α-syn、IL-1β、IL-18表达增加,差异有统计学意义(P<0.01); 与MPTP组相比, MPTP+红景天苷(40 mg/kg)组、MPTP+红景天苷(60 mg/kg)小鼠脑组织TH、Nrf2、NQO1表达增加,α-syn、IL-1β、IL-18表达减少,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01), 见图2。

A: TH、α-syn、Nrf2、NQO1表达情况(免疫组化染色法,标尺20 μm); B、C: IL-1β、IL-18表达情况(与对照组比较, ∗∗P<0.01; 与MPTP组比较, #P<0.05, ##P<0.01)。图2 各组小鼠脑组织TH、α-syn、Nrf2、NQO1、IL-1β和 IL-18表达情况

2.3 红景天苷对MPTP诱导SN4741细胞凋亡和IL-1β、IL-18表达的影响

TUNEL实验结果显示, MPTP组细胞凋亡相较对照组增加, MPTP+红景天苷(10 μmol/L)组、MPTP+红景天苷(50 μmol/L)组细胞凋亡少于MPTP组但多于对照组,差异有统计学意义(P<0.05), 见图3A。

ELISA检测结果显示, MPTP组细胞IL-1β、IL-18表达相较对照组增加, MPTP+红景天苷(10 μmol/L)组、MPTP+红景天苷(50 μmol/L)组细胞IL-1β、IL-18表达均少于MPTP组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01), 见图3B、图3C。

A: 细胞凋亡情况(TUNEL染色法,标尺20 μm); B: IL-1β、IL-18表达(与对照组比较, ∗∗P<0.01; 与MPTP组比较, #P<0.05, ##P<0.01)。图3 各组SN4741细胞TUNEL实验结果和ELISA实验结果

2.4 红景天苷对MPTP诱导SN4741细胞TH、α-syn、Nrf2、NQO1表达的影响

免疫荧光实验结果显示,与对照组相比, MPTP组细胞TH、Nrf2、NQO1表达减少,α-syn表达增加,差异有统计学意义(P<0.05); 与MPTP组相比,红景天苷(10 μmol/L)组、红景天苷(50 μmol/L)组细胞TH、Nrf2、NQO1表达增加,α-syn表达减少,差异有统计学意义(P<0.05),见图4。

2.5 红景天苷通过Nrf2-ARE信号通路改善MPTP诱导SN4741细胞的凋亡情况

qRT-PCR实验结果显示, si-Nrf2组Nrf2mRNA表达低于对照组和si-NC组,差异有统计学意义(P<0.01), 见图5A; si-NQO1组NQO1mRNA表达低于对照组和si-NC组,差异有统计学意义(P<0.01), 见图5B。

免疫荧光实验结果显示,分别阻断Nrf2、NQO1表达后, MPTP组细胞凋亡多于对照组,差异有统计学意义(P<0.05); MPTP+红景天苷(50 μmol/L)组细胞凋亡多于对照组,差异有统计学意义(P<0.05), 与MPTP组差异无统计学意义(P>0.05), 见图5C、图5D。

A: TH; B: NQO1; C: Nrf2; D: α-syn。图4 各组SN4741细胞TH、α-syn、Nrf2和NQO1的表达(免疫荧光染色法)

A、B: qRT-PCR实验结果(与对照组比较, ∗P<0.05, ∗∗P<0.01; 与si-NC组比较,##P<0.01); C、D: 免疫荧光实验结果(免疫荧光染色法)。图5 各组SN4741细胞Nrf2、NQO1表达情况

3 讨 论

红景天苷具有多种药理活性,在体外和体内都表现出抗炎和抗氧化作用[8]。PD是一种常见的年龄相关的神经退行性疾病,典型特征是多巴胺能神经元缺失[9]。PD患者的神经元数量逐渐减少,其中至少80%的纹状体神经元发生丢失[10]。MPTP是一种神经元选择性毒素,可以穿越血脑屏障,并在星形胶质细胞和5-羟色胺能神经元内的单胺氧化酶B作用下转变为强毒性的1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP1), 释放到细胞外。MPP1无法穿越血脑屏障,而是经多巴胺转运体进入多巴胺能神经末梢和胞体,选择性破坏黑质多巴胺能神经元,进而诱发PD症状[11]。SN4741细胞为小鼠多巴胺能神经细胞系,已被广泛用作体外PD模型。本研究以MPTP诱导的多巴胺能神经元丢失C57BL/6小鼠和MPTP诱导的SN4741细胞作为PD的体内外实验模型,结果表明,红景天苷能有效改善MPTP诱导的行为障碍。TH是多巴胺能生物合成中的一种限速酶,与PD的发生发展密切相关[12]。本研究表明, MPTP处理的小鼠TH阳性神经元减少,而红景天苷可以增加脑黑质和纹状体中的TH阳性细胞。蛋白质降解缺陷在神经退行性病理过程中亦很常见, α-syn的过度积累是PD的另一个典型病理特征。研究[13]表明, α-syn聚集物可能通过小胶质细胞的内吞作用激活NLRP3炎症小体,参与PD的发病机制。本研究结果显示,红景天苷处理可显著减少α-syn在体内和体外的积累,表明红景天苷可能是一种很有前途的PD治疗药物。虽然PD的确切发病机制尚不明确,但既往研究已证实炎症、氧化应激在PD的发生发展中起着关键作用,例如炎症因子IL-1β、IL-18。本研究结果显示,红景天苷在体内和体外均可显著抑制MPTP诱导的IL-1β、IL-18水平升高。

Nrf2是一种转录因子,在稳态条件下通过与Kelch样ECH相关蛋白1(KEAP1)结合而在大多数组织和细胞的细胞质中低水平表达[14]。Nrf2响应 KEAP1感知的应激信号而释放,易位到细胞核,积累并与靶基因启动子的ARE结合,进而启动受ARE调控的NQO1等基因的转录,以保护细胞免受氧化应激引起的损伤并维持氧化还原稳态[15]。研究[16]表明, Nrf2-ARE信号通路在PD进展过程中发挥重要作用。本研究结果显示,红景天苷在体内外均显著激活了Nrf2-ARE信号通路,这可能是红景天苷减轻PD的作用靶点。为了进一步探讨红景天苷对PD的治疗作用与Nrf2-ARE信号通路之间的关系,本研究以siRNA阻断Nrf2在SN4741细胞中的表达,发现红景天苷对MPTP诱导SN4741细胞凋亡的保护作用消失,提示红景天苷很可能通过Nrf2-ARE信号通路发挥减轻PD的作用。

综上所述,红景天苷对PD具有治疗作用,其可能通过Nrf2-ARE信号通路而减轻神经元细胞凋亡情况,有望成为一种新的PD治疗药物。