血清微小RNA-20a-5p、微小RNA-128-3p与缺氧缺血性脑病患儿脑神经发育的关系

朱瑞伍, 郭晓杰, 张 庆

(河南省第二人民医院 新生儿重症监护室, 河南 郑州, 450000)

缺氧缺血性脑病(HIE)属脑损伤疾病,是因婴儿出生时含氧血液流向大脑受阻所致,可引起血脑屏障通透性受损、能量衰竭、细胞离子稳态丧失、酸中毒、兴奋性中毒、自由基介导的毒性、生长因子缺乏等多种病理生理学机制,导致新生儿出现各种急性和慢性症状,产生严重的后遗症,甚至死亡[1-2]。HIE是全球新生儿脑损伤的主要原因,且早产儿HIE的发病率显著高于足月儿[3]。轻度HIE可能发育正常,仅有轻度脑发育延迟或者脑损伤可以完全恢复,重度HIE有60%的死亡风险,几乎所有的幸存者都会出现残疾[4]。目前,在HIE早产儿的病情判断方面,仍缺乏有效的生物学标志物。微小核糖核酸(miRNAs)具有高度的序列保守性、表达时机和组织特异性,其表达失调已被证明是多种疾病诊断和预后的生物标志物[5]。微小RNA-20a-5p(miR-20a-5p)是研究比较多的miRNA, 其参与持续增殖信号的调节、免疫生长抑制、侵袭性和转移性激活、血管生成能力、抵抗细胞死亡、避免免疫损伤等多种生理机制,与呼吸系统疾病、心血管疾病、癌症、脑卒中等多种疾病的发生、发展密切相关[6-7]。微小RNA-128-3p(miR-128-3p)是miRNA的重要成员,与增殖、凋亡和转移等多种细胞内生物学过程相关。研究[8]表明miR-20a-5p、miR-128-3p均可影响神经元分化因子的表达,与脑损伤相关。本研究检测HIE早产儿血清中miR-20a-5p、miR-128-3p的表达水平,分析其与脑神经发育的相关性,现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2020年6月—2022年6月在河南省第二人民医院分娩的95例HIE早产儿为HIE组,其中男53例,女42例; 分娩方式为顺产34例,剖宫产61例; 胎龄31～36周,平均(33.37±2.23)周; 出生体质量1 504～2 480 g, 平均(2 058.57±187.56) g。根据HIE早产儿病情严重程度[9], 将其分为轻度组(n=27)、中度组(n=46)和重度组(n=22)。纳入标准: ① 符合HIE相关诊断标准者[9]; ② 胎龄<37周者; ③ 早产儿临床资料完整; ④ 早产儿家属详知此项研究内容,并自愿签署同意书。排除标准: ① 先天畸形者; ② 先天性疾病以及外伤引起的脑损伤者; ③ 出生即存在严重疾病而无法存活者; ④ 急性及慢性感染性疾病者; ⑤ 肝、肾等脏器功能严重障碍者。本研究遵循《世界医学协会赫尔辛基宣言》。另选取同期95例无HIE早产儿作为对照组,其中男42例,女53例; 分娩方式为顺产31例,剖宫产64例; 胎龄31～36周,平均(33.58±2.35)周; 出生体质量1 720～2 507 g, 平均(2 064.33±177.65) g。2组性别、分娩方式、胎龄、出生体质量等一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.5), 具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 样本收集: HIE患儿在出生后3、14 d, 对照组在出生后3 d, 空腹采血3～5 mL收集于干燥试管中,离心半径为12 cm, 时间为10 min, 分离血清后放入-20 ℃冰箱中保存待检。

1.2.2 血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平检测: 采用RNA提取试剂盒(上海生工生物有限公司)提取血清样品总RNA, 采用逆转录试剂盒(德国Qiagen公司),按其说明书逆转录合成cDNA。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测血清中miR-20a-5p、miR-128-3p的相对表达量。根据ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)说明书配置反应体系。反应程序为: 95 ℃预变性5 min, 95 ℃变性10 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸30 s, 40个循环。在ABI 7500 Fast系统上进行qRT-PCR。以U6作为内参,根据2-△△Ct计算miR-20a-5p、miR-128-3p基因的相对表达量。基因引物经设计软件设计后由上海生工生物工程有限公司合成,见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 Apgar评分: 矫正胎龄40周后3、14 d, 从一般反应、原始反射等5个方面对早产儿进行新生儿神经行为测定评分法(NBNA)评定[10], 从呼吸、心率等5个方面对早产儿进行出生5 min Apgar评分[11]。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 HIE组与对照组血清miR-20a-5p、miR-128-3p、Apgar评分、NBNA评分比较

出生3 d时,与对照组相比, HIE组血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平升高, NBNA评分、Apgar评分降低,差异均有统计学意义(P<0.05), 见表2。

表2 2组血清miR-20a-5p、miR-128-3p、Apgar评分、NBNA评分比较

2.2 不同胎龄早产儿出生3 d血清miR-20a-5p、miR-28-3p水平比较

不同胎龄的HIE组患儿出生3 d血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05); 不同胎龄的患儿出生3 d血清miR-20a-5p、miR-28-3p水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同胎龄的早产儿出生3 d血清miR-20a-5p、miR-28-3p水平比较

2.3 不同严重程度HIE早产儿血清miR-20a-5p、miR-128-3p、Apgar评分、NBNA评分比较

出生3 d时,重度组血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平高于中度组、轻度组, NBNA评分、Apgar评分低于中度组、轻度组; 中度组血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平高于轻度组, NBNA评分、Apgar评分低于轻度组; 上述指标的组间差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同严重程度HIE早产儿血清miR-20a-5p、miR-128-3p、NBNA评分、Apgar评分比较

2.4 出生后3 d与出生后14 d血清miR-20a-5p、miR-128-3p、NBNA评分比较

HIE早产儿出生后14 d血清miR-20a-5p、miR-128-3p低于出生后3 d, NBNA评分高于出生后3 d, 差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 HIE早产儿出生后3 d与出生后14 d血清miR-20a-5p、miR-128-3p、NBNA评分比较

2.5 血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平与Apgar评分、NBNA评分的相关性

Spearman分析结果显示,出生后3 d时, HIE患儿血清miR-20a-5p水平与Apgar评分呈负相关(r=-0.659,P<0.001), 血清miR-128-3p水平与Apgar评分呈负相关(r=-0.582,P<0.001); HIE患儿血清miR-20a-5p水平与NBNA评分呈负相关(r=-0.548,P<0.001), 血清miR-128-3p水平与NBNA评分呈负相关(r=-0.499,P<0.001)。

2.6 血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平对早产儿发生HIE的预测价值

出生3 d时,血清miR-20a-5p预测早产儿发生HIE的曲线下面积(AUC)为0.854, 血清miR-128-3p预测早产儿发生HIE的AUC为0.786, 二者联合预测早产儿发生HIE的AUC为0.920。二者联合预测早产儿发生HIE的价值优于miR-20a-5p、miR-128-3p单独预测(P<0.05), 见表6、图1。

表6 血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平对早产儿发生HIE的预测价值

3 讨 论

由婴儿大脑缺氧引起的HIE是全球新生儿神经系统发病率和病死率升高的主要原因之一,围产期窒息几乎可以影响所有器官[12]。全世界每年约有75万例婴儿患有中度或重度HIE, 导致约40万例婴儿出现神经发育障碍[13]。孕24～40周时,胎脑发育迅速,易受到缺氧缺血、炎症、自由基、兴奋性毒性等损伤,因此早产儿更容易发生HIE[14]。目前HIE脑损伤的分子机制和途径在很大程度上仍不清楚,而且中度及重度HIE治疗难、预后差,这使得HIE的诊断和治疗至关重要[15]。

miRNA是重要的调节因子,在细胞增殖、分化、迁移、分泌和凋亡等不同生理条件下发挥着关键作用[16]。miR-20a-5p和miR-128-3p都属于miRNA家族,与多种疾病的发生发展密切相关。QI Y等[17]发现miR-20a-5p在肝细胞癌中表达上调,通过参与调节肝细胞癌肿瘤微环境来促进肿瘤的发生发展。LIU J Z等[18]发现骨髓间充质干细胞软骨分化过程中miR-20a-5p基因表达上调,靶向成纤维细胞生长因子促进骨关节炎中的软骨细胞凋亡、增殖和炎症。ZHU M S等[19]发现miR-128-3p在骨肉瘤细胞中起致癌基因的作用,可作为骨肉瘤临床和预后重要的生物标志物和治疗靶点。YANG P等[20]发现miR-128-3p可通过靶向脂多糖调控细胞凋亡和炎症反应,可能为脓毒症的治疗提供策略。本研究结果显示, miR-20a-5p、miR-128-3p在HIE早产儿中表达上调,轻度组、中度组、重度组血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平依次升高,早产儿出生后14 d血清miR-20a-5p、miR-128-3p低于出生后3 d, 提示miR-20a-5p、miR-128-3p可能与HIE早产儿的发病机制、病情严重程度和发展密切相关,有望成为HIE早产儿诊断以及病情严重程度判断的潜在标志物。BAI B等[21]发现miR-20a-5p和miR-155-5p可能通过影响下游基因的表达潜在影响细胞凋亡和痛风的发生发展。ROC曲线显示, miR-20a-5p、miR-128-3p二者联合预测早产儿发生HIE的价值优于各自单独预测。

Apgar评分是常用的评估新生儿呼吸功能的指标, NBNA评分是常用的评估新生儿神经发育的指标[22]。陈晓玲等[23]发现, HIE组患儿的Apgar评分、NBNA评分显著低于对照组。本研究发现, HIE早产儿Apgar评分、出生3 d的NBNA评分低于对照组; 轻度组、中度组、重度组Apgar评分、NBNA评分依次降低; 早产儿出生后14 d的NBNA评分显著高于出生后3 d; Spearman分析结果显示,出生3 d时, HIE患儿血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平分别与Apgar评分、NBNA评分呈显著负相关,提示HIE早产儿血清miR-20a-5p和miR-128-3p水平与脑神经发育密切相关。总之, HIE早产儿血清miR-20a-5p、miR-128-3p表达升高,二者联合检测可较好地判断早产儿HIE的发生。