生物通风法修复石油烃污染土壤

殷鹂婷，韩书新，刁志龙，王 勇，蒋梦涵，高焕方

（1. 重庆理工大学 化学化工学院，重庆 400054；2. 黑龙江省生态气象中心，黑龙江 哈尔滨 150030；3. 重庆汇亚环保工程有限公司，重庆 400041；4. 正和绿源检测技术（重庆）有限公司，重庆 400072）

石油烃（TPH）是一种持久性有机污染物，具有致癌、致畸和致突变性［1-2］，主要来自于石油开采、运输及加工过程中泵、管线、油罐等设施和设备的泄漏。TPH一旦进入土壤，一方面会通过食物链在人和动物体内富集，对人体健康造成危害；另一方面还会破坏土壤结构、抑制植物生长，对生态环境造成严重危害。近年来，TPH污染已逐渐成为石油、石化行业土壤污染的主要形式。TPH污染土壤的修复方法主要有物理修复、化学修复和生物修复3种。其中，物理修复（如吸附、热处理、隔离等）和化学修复（如萃取、淋洗、化学氧化等）处理成本高、二次污染严重［3-5］，生物修复虽然具有修复效果好、处理费用低、不产生二次污染等优点，但却存在耗时长的缺陷。生物通风是将物理修复与生物修复结合起来的一种土壤修复技术，对TPH污染土壤具有良好的修复效果［6］。THOMÉ等［7］利用生物通风技术修复受柴油污染的黏土土壤，120 d后，TPH去除率达到85%。张煜轩［8］采用异位生物通风技术修复焦化类污染土壤，考察了通风条件和菌剂添加量对修复效果的影响，结果表明，在96 d的试验周期内，目标污染物苯并［a］芘、苯并［a］蒽和二苯并［a，h］蒽等均有良好的去除效果。尽管生物通风技术在TPH污染土壤修复方面已有应用，但鉴于TPH污染土壤本身的复杂性，目前对于影响生物通风修复效果的因素，如初始TPH含量、土壤含水率、通风强度和通风时间等的研究还不够透彻，对微生物降解TPH的机理也不甚清楚，亟需深入研究［9-11］。

本工作采用生物通风技术修复受TPH污染的土壤，考察了初始TPH含量、土壤中C，N，P元素质量比（C∶N∶P）、土壤含水率和通风速率4种因素对TPH降解率的影响，探讨了TPH的降解机制，为TPH污染土壤的修复作参考。

1 实验部分

1.1 实验材料和仪器

土壤取自重庆理工大学校园内，采集表层（0～15 cm）土样，自然风干后，过2 mm筛备用。经检测，土壤pH 7.74、含水率4.81%、有机质含量（w）1.40%。

TPH污染土壤的制备：将40#机油在适量石油醚中溶解，加入土壤中，充分混合，制备成不同TPH含量（分别为6 000，8 000，10 000，12 000，14 000 mg/kg）的污染土壤；将污染土壤在阴凉通风处放置14 d，每2 d搅拌1次，以确保石油醚完全挥发。

实验所用菌液是由4株真菌所构建的高效TPH降解菌群。4株真菌分别为硬孔菌（Rigidoporus vinctus）、杂色曲霉菌（Aspergillus versicolor）、淡紫拟青霉菌（Purureocillium lilacinum）和曲霉菌（Aspergillus japonicus），均为本课题组筛选所得。

GC-2014型气相色谱仪：日本岛津公司；Agilent 8860-5977B型气相色谱质谱联用仪（GCMS）：美国安捷伦公司；SEP-100型生化培养箱：上海精其仪器有限公司。

1.2 实验装置

实验装置图见图1。整个实验装置由生物通风柱（由有机玻璃柱制成，内径80 mm、高500 mm）、充气泵、气体流量计、装有NaOH溶液的CO2去除瓶、装有NaOH溶液的CO2收集瓶和活性炭管等组成。生物通风柱侧壁设置6个直径均为10 mm的圆形取样口（从下到上分别记作A#-F#），取样口高度距柱底分别为60，110，195，285，370，415 mm，取样口用硅胶垫密封。

图1 实验装置图

1.3 实验方法

1.3.1 单因素实验

在TPH含量为10 000 mg/kg的污染土壤中分别添加一定量的硝酸铵和磷酸氢二钾，调节土壤C∶N∶P为100∶15∶1；将污染土壤装填至生物通风柱中，填充高度430 mm；在通风速率150 mL/min的条件下，考察土壤含水率对TPH降解率的影响。分别改变C∶N∶P、通风速率和初始TPH含量，考察不同因素对TPH降解率的影响。

1.3.2 正交实验

为了进一步考察不同因素对TPH降解率的影响，在单因素实验的基础上，设计了4因素3水平L9（34）的正交实验（表1），考察修复期间（0～63 d）污染土壤中TPH降解率的变化情况。

表1 生物通风修复TPH污染土壤正交实验因素与水平

1.4 分析方法

采用气相色谱仪测定土壤样品中TPH的含量［12］，结果取6个采样点的平均值。

采用GC-MS测定TPH降解产物。具体步骤如下：生物通风结束后，从6个取样口中各称取5.0 g左右的土壤样品加入到研钵中，同时加入等质量的无水硫酸钠，研磨至干燥态；将样品移入微波消解管中，加入20 mL体积比为1∶1的丙酮-正己烷混合溶液，在120 ℃下微波萃取30 min；萃取液经浓缩、干燥后，定容至1 mL，上机检测。测试条件：色谱柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），初始温度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升温至320 ℃并保持59 min。不分流，进样量1 μL。质谱采用EI离子源，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃。

2 结果与讨论

2.1 影响TPH降解率的因素

2.1.1 土壤含水率

在初始TPH含量为10 000 mg/kg、通风速率为150 mL/min、C∶N∶P为100∶15∶1的条件下，考察土壤含水率对TPH降解率的影响，结果见图2。

图2 土壤含水率对TPH降解率的影响

由图2可见：随着修复时间的延长，TPH降解率逐渐增加；当土壤含水率从10%增加到20%时，TPH的降解率不断上升，当修复时间为35 d时，TPH降解率达到最大，为37.7%；继续增加土壤含水率至25%和30%时，TPH降解率明显降低。研究表明，适宜的土壤含水率不仅可以促进微生物的代谢活动，增加其细胞活性，还能够维持土壤孔隙，增加土壤供氧能力，有利于好氧微生物发挥作用［13］。当土壤含水率过低时，营养物质不能及时传递给微生物，导致微生物活性受到抑制，呼吸作用减弱，从而影响TPH的降解；随着土壤含水率的逐渐增大，土壤中越来越容易形成厌氧环境，不利于好氧微生物的生长；当土壤含水率超过25%时，土壤呈泥浆状，土壤孔隙度降低，氧气难以扩散，进而影响微生物活性，TPH降解率降低［14］。一般认为土壤含水率为 15%～20%时，生物修复的效果最佳［15］。综上，选择适宜的土壤含水率为20%。

2.1.2 C∶N∶P

在初始TPH含量为10 000 mg/kg、土壤含水率为20%、通风速率为150 mL/min的条件下，考察C∶N∶P对TPH降解率的影响，结果见图3。

图3 C∶N∶P对TPH降解率的影响

由图3可见：当C∶N∶P由100∶10∶1增加至100∶20∶1时，TPH降解率逐渐增大；当C∶N∶P为100∶20∶1、修复时间为35 d时，TPH降解率达到最大，为39.4%；继续增加C∶N∶P至100∶25∶1和100∶30∶1时，TPH降解率逐渐降低。土壤中C，N，P等营养物质的含量对微生物降解TPH影响较大。一方面微生物的生长代谢离不开C，N，P等营养物质，TPH可以为微生物生长提供碳源，N、P等营养物质能够促进细胞生长、增强微生物活性、加速微生物对TPH的降解。另一方面，当N、P等营养物质含量过高时，会对微生物生长产生毒害作用，不利于微生物产生相应的降解酶，降低了微生物对TPH的降解率［16-18］。综上，选择适宜的C∶N∶P为100∶20∶1。

2.1.3 通风速率

在初始TPH含量为10 000 mg/kg、土壤含水率为20%、C∶N∶P为100∶20∶1的条件下，考察通风速率对TPH降解率的影响，结果见图4。由图4可见：当修复时间为0～7 d时，随着通风速率的增加，TPH降解率逐渐增加；随着修复时间的延长，当通风速率由50 mL/min增加至100 mL/min时，TPH降解率逐渐增大，继续增加通风速率至150 mL/min，TPH降解率略有降低，进一步增大通风速率至250 mL/min时，TPH降解率明显降低；当通风速率为100 mL/min、修复时间为35 d时，TPH降解率达到最大，为 40.3%。在修复初期（0～7 d），微生物尚未适应新的土壤环境，此时TPH的去除主要依靠挥发作用，随着修复时间的延长，微生物逐渐适应土壤环境并开始大量繁殖，因此，修复中、后期，TPH的去除主要依赖微生物的降解作用。土壤中氧含量是影响TPH生物降解率的主要因素［19］。微生物在有氧条件下，以TPH为碳源和能源进行代谢合成自身物质，当土壤中氧含量不足时，会抑制好氧微生物的生长，进而影响对TPH的降解，当土壤中氧含量充足时，TPH容易被微生物降解。适当的通风速率可以保证土壤中氧含量充足，但通风速率过大可能会使土壤内部温度降低，进而影响微生物的活性，导致TPH降解率下降［20］。综上，选择适宜的通风速率为100 mL/min。

图4 通风速率对TPH降解率的影响

2.1.4 初始TPH含量

在土壤含水率为20%、C∶N∶P为100∶20∶1、通风速率为100 mL/min的条件下，考察初始TPH含量对其降解率的影响，结果见图5。由图5可见：当初始TPH含量由6 000 mg/kg增加至10 000 mg/kg时，TPH降解率逐渐增大；在修复中、后期，初始TPH含量增加至12 000 mg/kg和14 000 mg/kg时，TPH降解率逐渐降低；当初始TPH含量为10 000 mg/kg、修复时间为35 d时，TPH降解率达到最大，为43.1%。TPH可以为微生物生长提供丰富的碳源，当土壤中初始TPH含量过低时不足以维持微生物的生长繁殖［21］，导致TPH降解率较低；随着土壤中初始TPH含量的升高，微生物的生长繁殖加快，微生物数量增多、活性增强，对TPH的降解率增大；当初始TPH含量过高时，会影响土壤的呼吸强度，阻碍土壤中营养物质和氧气的传输，抑制微生物的活性，导致TPH降解率降低［22-23］。综上，选择适宜的初始TPH含量为10 000 mg/kg。

图5 初始TPH含量对其降解率的影响

2.2 正交实验结果分析

为了进一步优化生物通风修复TPH污染土壤的工艺条件，在单因素实验的基础上开展正交实验，考察不同因素对TPH降解率的影响，结果见表2。由表2可见：生物通风修复TPH污染土壤的最佳实验条件为A2B1C3D2，即初始TPH含量10 000 mg/kg、C∶N∶P 100∶15∶1、土壤含水率20%、通风速率100 mL/min。在最佳实验条件下修复63 d后，污染土壤中TPH的含量降低至3 167 mg/kg，降解率为68.3%；各因素对TPH降解率影响的大小顺序为初始TPH含量（A）＞土壤含水率（C）＞C∶N∶P（B）＞通风速率（D），表明初始TPH含量是影响其降解率的最主要因素，这与李琦［24］的研究结果相一致。

表2 正交实验结果

2.3 TPH降解产物及降解机理

以TPH降解率最高的生物通风柱为对象，采用GC-MS分析土壤修复前后TPH组分和含量的变化，结果见图6。按碳骨架类型的不同，TPH可分为脂肪族、脂环族和芳香族化合物3类。由图6a可见：生物通风前后，各TPH组分含量的变化明显不同，其中脂肪族化合物的相对含量显著降低，由修复前的27.9%降低至12.5%，脂环族和芳香族化合物的相对含量有所增加，分别由修复前的52.5%和19.6%增加至61.3%和26.3%，表明脂肪族化合物比脂环族和芳香族化合物容易被降解，即具有开链碳结构的TPH比具有环状碳结构的TPH更容易被微生物降解。从TPH碳链的长短来看（图6b）：生物通风修复后，C10～C16的相对含量明显降低，由修复前的31.1%降低至16.7%；C17～C21和C22～C40的相对含量有所升高，分别由修复前的24.0%和44.9%升高至29.2%和54.2%，可见，TPH的碳链越短越容易被微生物降解。

图6 修复前后土壤中各TPH组分和含量的变化

生物通风修复前，采用GC-MS可以从TPH污染土壤中检测到9，10-二甲基蒽（见图7）；经生物通风修复后，从TPH污染土壤中只能检测到10-甲基蒽-9-甲醛（图8）。可以认为这是9，10-二甲基蒽上的甲基经加氧酶氧化成酚羟基、再经过脱氢酶还原成醛的过程，表明此时多环芳烃已开始降解。此外，在修复前的TPH污染土壤中可以检测到1-氯代二十碳烷，在修复后的土壤样品中只能检测到二十烷，表明卤代脂肪烃已经开始取代脱氯，长链烷烃也开始降解。在适宜的条件下，TPH作为碳源，为微生物的生长繁殖提供能量，在一系列酶的作用下，微生物通过氧化、水解、烷基化和去烷基化等代谢方式将TPH逐步降解为CO2和H2O等，且TPH的结构越简单，越容易被降解［25-26］。

图7 9，10-二甲基蒽的质谱图

图8 10-甲基蒽-9-甲醛的质谱图

不同TPH的好氧降解过程见图9。由图9可见：链烷烃的降解主要为末端氧化和次末端氧化。在末端氧化过程中，链烷烃被烷烃加氧酶依次氧化为伯醇、脂肪酸或醛，脂肪酸经过β-氧化进一步转化为乙酰辅酶A（CoA），随后进入三羧酸（TCA）循环被进一步分解，最终产物为CO2和H2O。烷烃发生次末端氧化时会首先形成仲醇，仲醇再转化为甲基酮，酮进一步代谢为酯，随后生成脂肪酸和伯醇，伯醇继续氧化为羧酸，羧酸与脂肪酸经过β-氧化后，进一步分解为CO2和H2O［27］。

图9 不同TPH的好氧降解过程

与链烷烃相比，环烷烃较难被微生物降解。其降解路径为：环烷烃首先经氧化酶氧化成环醇，脱氢后形成环酮，环酮可以进一步氧化生成内酯、也可以开环生成脂肪酸，再通过β-氧化最终分解为CO2和 H2O［28］。

以苯为例，芳香族化合物的降解路径为：加氧酶将苯环羟基化生成邻苯二酚，再经过邻苯二酚双加氧酶的作用在邻位或间位开环，其中邻位开环生成己二烯二酸，己二烯二酸进一步氧化生成β-酮己二酸，最后形成琥珀酸和CoA参与到TCA循环中；间位开环生成2-羟基己二烯半醛酸，开环产物分解为甲酸、乙醛和丙酮酸参与到TCA循环中［29］。

3 结论

a）正交实验结果表明，在初始TPH含量10 000 mg/kg、C∶N∶P 100∶15∶1、土壤含水率20%、通风速率100 mL/min的条件下，生物修复63 d后，污染土壤中TPH的含量降低至3 167 mg/kg，降解率为68.3%；各因素对TPH降解率影响的大小顺序为初始TPH含量＞土壤含水率＞C∶N∶P＞通风速率。

b）从碳骨架分析，生物通风修复后，脂肪族化合物的相对含量显著降低，由修复前的27.9%降低至12.5%，脂环族化合物和芳香族化合物的相对含量有所增加，分别由修复前的52.5%和19.6%增加至61.3%和26.3%，表明脂肪族化合物比脂环族和芳香族化合物容易被降解，即具有开链碳结构的TPH比具有环状碳结构的TPH更容易被微生物降解。

c）从TPH碳链的长短来看，生物通风修复后，C10～C16的相对含量明显降低，由修复前的31.1%降低至16.7%，C17～C21和C22～C40的相对含量有所升高，分别由修复前的24.0%和44.9%升高至29.2%和54.2%，表明TPH的碳链越短越容易被微生物降解。

d）在适宜的条件下，微生物以TPH为碳源，在一系列酶的作用下，通过氧化、水解、烷基化和去烷基化等代谢方式将TPH逐步降解为CO2和H2O等，且TPH结构越简单，越容易被降解。