多杀性巴氏杆菌诊断技术及防控策略研究进展

李 昕，张正刚，郭亚男，宗亮泽，梁小军

（1.宁夏兽药饲料监察所，银川 750002；2.宁夏农林科学院动物科学研究所，银川 750002；3.宁夏大学动物科技学院，银川 750021；4.宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心，银川 750002）

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）是条件致病菌，可引起多种家畜和野生动物及人类的感染［1］。由Louis Pasteur 于1887 年在禽霍乱病例中分离得到，命名为巴斯德氏菌。其主要存在于动物的口腔、鼻咽和上呼吸道，通过呼吸道分泌物和飞沫进行传播，致使宿主的呼吸道系统、淋巴系统等发生感染，从而致病，是一种重要的人畜共患疾病。但其对人的感染报道较少，在人体中主要通过动物咬伤传播，感染后可导致呼吸系统感染，引发败血症、脑膜炎等。1994 年起列为3 个亚种，即多杀亚种（P.multocidassp.multicida）、败血亚种（P.multocidassp.Septzca）及杀禽亚种（P.multocidassp.Gallicida）［2］。

1 巴氏杆菌的特性

1.1 巴氏杆菌的结构和培养特性

P.multocida是小型、非运动兼性厌氧革兰氏阴性球杆菌，无鞭毛，无芽孢，常以单个或成双分布。中央微凸，宽度为0.3～1.0 μm，长度为1.0～2.0 μm。P.multocida菌株对培养条件营养要求苛刻，可以在营养丰富的培养基上培养，如在胰蛋白酶大豆琼脂、巧克力琼脂或脑心浸液琼脂上生长良好，在5%无菌脱纤维羊血平板上可生长形成直径约1 mm 灰白色、黏稠状菌落，无溶血环产生［3］。在普通培养基和麦康凯（MacConkey）琼脂培养基上不生长［4］。P.multocida在培养过程中可分解果糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖，产酸而不产气体；对过氧化氢酶、氧化酶、吲哚和鸟氨酸脱羧酶反应呈阳性，但对脲酶、甲基红试验和VP 试验均为阴性，不液化明胶、石蕊牛乳无变化，能产生硫化氢［5］。

1.2 巴氏杆菌的发病机制

P.multocida作为重要的呼吸道病原体，可通过诱发宿主上皮屏障的功能障碍，从而导致细菌入侵以及气道和肺炎症性疾病的发展［6］。其发病机制的分子基础主要涉及荚膜、脂多糖（LPS）、鞭毛、粘附素、多杀性巴氏杆菌毒素（P.multocidatoxin，PMT）和外膜蛋白等毒力因子［7］，编码P.multocida特征的基因包括exbB、exbD、fimA、fur、hgbA、hgbB、hsf1、hsf2、nanB、nanH、oma87、ompA、ompH、pfhA、plpB、plpE、pmHAS、psl、ptfA、sodA、sodC、tadD、tbpA、tonB和toxA。这些编码毒力因子基因对巴氏杆菌的粘附、入侵和抗杀伤至关重要［8］。呼吸道疾病是一种多因素疾病，其特征是细菌病原体侵入下呼吸道，诱发因素是病毒合并感染、断奶应激、管理不善、饮食改变、天气变化、运输和拍卖市场的混合等［9］。P.multocida感染主要为急性呼吸道疾病，临床症状为高热、鼻涕，并伴有大量流涎，随后迅速出现呼吸窘迫、脓毒性休克伴有出血，几天内死亡。尸检显示气管、肺、小肠和肝脏极度充血［10］。潜伏期一般为2～5 d，幼畜抵抗力较弱，较为易感。多种微生物感染比单一物种感染表现出更为复杂的病理特征［11］。

2 多杀性巴氏杆菌诊断技术

2.1 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA 片段的分子生物学技术，可看作是生物体外的特殊DNA 复制，其最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR 与凝胶电泳等现代分子生物学技术的结合使用，越来越多地用于细菌的分离与鉴定，能够扩增和检测来自一个或几个靶分子的特定核苷酸序列，提高检测效率。与单次PCR 相比，多重PCR可以同时检测多种病原体，具有节省时间、提高效率和成本低等优点，为鉴别诊断提供了很好的选择。DNA 检测包括4 个步骤：DNA 提取、DNA 扩增、电泳和凝胶图像分析，此过程非常耗时并且分析通量较低。此外，在转移扩增产物进行荧光检测和分析的过程中，由于残留污染，假阳性结果的风险较高。PCR 按原理和用途可分为常规PCR、实时荧光定量PCR 等，是多个领域应用广泛的重要分子生物学技术［12］。施少华等［13］建立了检测禽多杀性巴氏杆菌的PCR 法，唐先春等［14］分别针对kmt和toxA基因设计引物进行扩增，能够同时检测并区分产毒素型与非产毒素型多杀性巴氏杆菌。

2.2 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR）是一种在DNA 扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA 序列进行定量分析的方法。该分子技术被广泛用于微生物学和临床诊断研究，可以实时检测核酸扩增产物的量，与常规方法相比，具有分析时间更短的特点［15，16］。1991 年，Holland 等［17］描述了一种技术，通过监测TaqDNA 聚合酶的5′→3′核酸内切酶活性对特异性寡探针/靶DNA 双链体的影响来检测扩增子，为使用荧光寡探针进行均相PCR 奠定了基础。该技术需要平台激发、检测荧光以及执行热循环。1992 年，Nakayama 等［18］描述了一种电荷耦合装置，用于定量传统的逆转录（RT）-PCR 产物。1993 年，Higuchi等［19］将该技术与热循环仪相结合，产生了第一个实时PCR 荧光激发和检测平台。实时荧光定量PCR 因其快速性、灵敏度高、重复性高并且结果可靠等优点已被广泛应用，根据与核酸的结合方式荧光定量PCR 被分为染料法和探针法。

荧光定量PCR 探针法就是在反应体系中除加入1 对特异性引物外，再加入1 条特异性荧光探针，此探针可与上下游引物之间的模板序列相匹配，最常用的就是TaqMan 探针。Real-timePCR 是在PCR扩增过程中，通过荧光信号对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR 扩增的指数时期，模板的Ct值与该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。定量分为相对定量、绝对定量。相对定量描述了目标序列量与其在相关基质中的水平相比的变化，绝对定量说明了样品中存在的核酸靶标相对于特定单位的确切数量［20］，通常因为相对定量提供了足够的信息，所以更容易开发。TaqMan 荧光定量PCR 是一种快速工具，每形成1 条DNA 双链，就有1个单位荧光信号产生，荧光信号强度变化与PCR 产物浓度变化呈正相关。根据Ct值，利用标准曲线即可计算这些生物的丰度值，从而为临床提供额外的数据。由于TaqMan 探针与模板的结合同样遵循碱基互补配对原则，1 条探针对应1 条模板链，因此，TaqMan 探针法比染料法有更高且有不同波长类型的荧光基团以供选择，可实现多重荧光定量PCR［21］。

荧光染料法中最常用的染料是SYBR Green I，利用SYBR Green I 与双链DNA 结合的特性，可以检测PCR 反应过程中所有的双链DNA，但无法区分不同双链DNA，还需要特异性较强的引物防止非特异性产物的产生［22］。在高温下，双链DNA 扩增子开始转化为单链（熔体），因此荧光的振幅下降。当50%的DNA 从双链熔化为单链时，此时的温度被称为解链温度（TM）［23］。

2.3 重组酶聚合酶扩增技术（RPA）

2006 年，Piepenburg 等［24］利用参与细胞DNA 合成、重组和修复的蛋白质开发了重组酶聚合酶扩增技术（RPA），RPA 是高灵敏度和高选择性的等温扩增技术，可在37～42 ℃操作，整个过程进行得非常快，只需少量的样品就能在1 min 内扩增至10～20个DNA 靶拷贝［25］。在RPA 中，重组酶与引物结合，所得复合物的引物与DNA 模板的同源序列结合，然后，链置换DNA 聚合酶延伸引物，单链DNA 结合蛋白（SSB）与未缠绕的链结合。因不需要热循环仪，RPA 比PCR 更适合在田间使用［26］。其扩增产物可以通过凝胶电泳、侧流色谱或荧光进行分析［27］。RPA对技术和设备的要求相对较低，具有使用方便、灵敏度高、耗时少、成本低等优点，在检测领域具有广阔的应用前景［28］。Zhao 等［29］将RPA 检测和侧流试纸（LFD）二者相组合，建立了鉴定多杀性巴氏杆菌保守基因Kmt1的RPA-LFD 检测方法，利用建立的方法和实时定量PCR 方法分别对来自62 个奶牛场的33 个鼻拭子和17 个新鲜肺样本进行检测，结果表明，RPA-LFD检测方法的临床特异性和灵敏度更高。

2.4 环介导等温扩增技术（LAMP）

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification ，LAMP）是由Notomi 等［30］在2000年开发的可在等温条件下以高特异性、高效率和快速性扩增DNA 的新方法。LAMP 经常用于检测人类、牲畜和植物的传染病，反应终点有多种检测方法，包括浊度法、琼脂糖凝胶电泳法和紫外光检测法［31］。LAMP 具有检测阈值低、速度快、检测所需设备简单等优点。该技术可与逆转录酶结合使用，也适用于RNA 的扩增（RT-LAMP）［32］。缺点是污染、序列相似性和引物二聚体引起扩增过程中的假阳性［33，34］。Bhimani 等［35］在2015 年对疑似禽霍乱和出血性败血症的死禽和动物（牛、水牛、绵羊和山羊）的不同组织中获得22 株P.multocida分离株，使用新设计的KMT1基因引物序列对Loop 介导的等温扩增（LAMP）进行鉴定，同时与PCR 检测方法相比较，结果表明LAMP 比PCR 更灵敏。Moustafa 等［36］开发了2 种LAMP 方法用来检测水牛出血性败血症（HS）相关菌株的多杀性巴氏杆菌DNA，对LAMP 检测结果与专为特异性检测HS 相关菌株的B∶2 血清型而设计的传统PCR 检测进行了验证，结果表明，HSLAMP 检测方法具有较高的敏感性和特异性。Pascual-garrigos 等［37］设计了一种LAMP 检测方法，使用具有89%分析特异性和99%分析灵敏度的荧光报告基因检测牛鼻标本中多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌和嗜血组织素的存在，结果与实验室对相同样品进行的PCR 测定有60%～100%的一致性。

3 多杀性巴氏杆菌的防控策略

P.multocida是一种高度传染性疾病，几乎影响所有的动物物种，控制措施昂贵且效果十分有限。牛巴氏杆菌病的诊断主要是临床表现、尸检和传统细菌学技术，但是这些技术被认为耗时且缺乏可靠性［38］。获得及时和准确的诊断具有挑战性［39］，因为不确定从样本中回收的病原体是否具有致病性。使用抑制微生物传播的消毒剂定期清洁宿主环境是预防该病原体引起的疾病的最佳方法。

用灭活细菌（细菌素）或减毒活细菌接种疫苗是预防和保护动物免受多杀性巴氏杆菌感染的有效和经济的方法［40］。对于多杀性巴氏杆菌病临床治疗的主要手段是使用广谱抗生素，治疗P.multocida的抗生素有多种，包括β-内酰胺类（最常见的是第3 代头孢菌素）、氟喹诺酮类、大环内酯类、四环素类、氟苯尼考和磺胺类［41，42］。在澳大利亚，当发现动物有巴氏杆菌感染的临床症状且无耐药性时，建议将四环素和替米考星作为呼吸道疾病（BRD）治疗的一线抗菌药物，当一线药物无效时，推荐将托拉霉素作为呼吸道疾病治疗的二线抗菌药物。然而，在商业实践中，现场兽医经常使用托拉霉素作为一线药物治疗。抗生素治疗可能由于多种原因失败，包括误诊、药物选择不当、给药率不当、脱水等。同时，抗生素滥用被认为是细菌耐药的主要原因，随着时间的推移，问题会恶化。由耐药细菌引起的治疗失败导致P.multocida发病率和死亡率增加。因此，对多杀性巴氏杆菌病和耐药性菌株的快速诊断有助于多杀性巴氏杆菌病的及时预防、控制和治疗。