响应面法优化黄芪总黄酮提取工艺及其生物活性分析

范龙泉,田 晶,孟 月,贺玉荣,刘 燕

山西工商学院 健康管理学院 (太原 030000)

黄芪,是豆科草本植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根,收载于《中国药典》(2015版),是我国特色大宗药材,有2 000多年的药用历史[1],在山西、陕西、内蒙、甘肃等地也有着悠久的食用历史[2]。黄芪富含多糖、皂苷、黄酮、氨基酸等多种活性成分[3-4],其中黄酮类物质具有降压降糖、抗肿瘤、抗病毒、调节免疫力、延缓衰老等功效[5-9]。近年来,随着中医药对疫情防治优势的突显,市场对黄芪的需求量持续走高,如何提升黄芪综合利用价值,全面开发、研制黄芪功能产品成为了研究重点。

目前,关于黄芪黄酮类物质提取研究相对较少,并且得率较低,如,贲永光等[10]采用纤维素酶法提取黄芪总黄酮,得率为0.402%;徐东生[11]采用微波消解仪提取黄芪黄酮,得率为0.489%;王梦茹等[12]采用闪式提取法提取黄芪黄酮的得率为0.663%。近期有研究表明,不同方法联合使用有望弥补单一方法不足,提升产物提取效率,姜莉等[13]研究了超声辅助提取、酶解提取、水磨提取,及分别联合亚临界提取对黄芪中活性成分得率的影响,结果表明,酶解辅助亚临界提取总黄酮效果较好,其得率为1.04%,并且联合提取所得提取液体外抗氧化能力均强于其它提取方法;贾颖等[14]采用加热辅助超声提取黄芪总黄酮得率为2.31%。为此,本研究拟将超声辅助提取法和微波辅助提取法联合运用,以期将超声波的空化效应和微波的强穿刺力共同作用于植物细胞内有效成分的提取,这种方法在其他植物中应用效果较好,如紫丁香、沙棘叶、柑橘皮等,而在黄芪黄酮提取方面未见报道。

本研究通过比较单辅助和联合辅助提取技术总黄酮得率的差异,判断方法可行性和实效性,在单因素试验基础上,采用响应面Box-Behnken试验设计得到最佳提取工艺参数,并通过测定抗氧化活性和抑菌活性,分析该技术方法对产物功能活性的影响,从而为黄芪黄酮类相关产品的研发和应用提供数据支撑和方法学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄芪,5年生,购于山西浑源万生黄芪股份有限公司,经中国农业科学院潘映红研究员鉴定属蒙古黄芪;大肠杆菌菌种、金黄色葡萄球菌菌种、枯草芽孢杆菌菌种,山西工商学院食品微生物实验室提供;维生素C标准品、芦丁标准品,北京索莱宝科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS),分析纯,合肥博美生物科技有限公司;氢氧化钠、硝酸铝、过硫酸钾,分析纯,天津市北辰方正试剂厂;无水乙醇,分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FW-100型高速万能粉碎机,北京永光明医疗仪器有限公司;KS-1000ZDN型超声萃取仪,昆山洁力美超声仪器有限公司;FCMC2-3SX-T型微波化学反应器,科瑞仪器有限公司;752型紫外分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司;YXQ-75SⅡ型高温灭菌锅、SW-CJ-2FD型超净工作台,上海博迅仪器有限公司;SPX-250B型恒温培养箱,天津泰斯特仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1黄芪总黄酮提取工艺流程

黄芪→粉碎→过筛→称重→加入乙醇溶液→超声提取→微波提取→抽滤,取滤液

(1)超声微波联合辅助提取黄芪总黄酮

挑选干净、整齐的黄芪饮片,于粉碎机中粉碎,过60目筛,称取5 g移入250 mL锥形瓶中,加入一定量的一定体积分数的乙醇溶液,封闭瓶口,恒定功率进行超声提取,再移入微波反应器进行微波提取,冷却至室温,抽滤,取滤液进行测定。

(2)单超声、微波辅助提取黄芪总黄酮

按照上面的步骤,单独超声提取或者微波提取后抽滤,取滤液,待测。分析比较超声辅助提取、微波辅助提取和超声微波联合辅助提取黄芪总黄酮含量的差异。

1.3.2黄芪总黄酮得率的测定

以芦丁标准品为对照,采用分光光度法测定样品总黄酮含量。参考麻明友等[15]方法绘制标准曲线,芦丁的线性回归方程为Y= 14.451X+ 0.000 3,R2=0.999 2。取1 mL黄芪总黄酮提取液,按照芦丁标准品的检测方法,在510 nm处测定其吸光度A,根据标准曲线计算黄酮浓度C,黄芪总黄酮得率公式如下:

(1)

式中:C为黄芪总黄酮浓度;V为提取液总体积,mL;N为稀释倍数;M为黄芪样品质量,g。

1.3.3单因素试验

在预试验的基础上,按照黄芪总黄酮提取工艺,以黄酮得率为检测指标,以不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50, g/mL)、乙醇溶剂体积分数(20%、30%、40%、50%、60%)、超声功率(300 W、400 W、500 W、600 W、700 W)、超声时间(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)、微波功率(150 W、200 W、250 W、300 W、350 W)、微波时间(20 s、30 s、40 s、50 s、60 s)进行单因素试验,确定各因素最适条件和优化范围。

1.3.4响应面优化试验

在以上单因素试验基础上,通过极差分析选取对黄芪中总黄酮得率影响较显著的因素和水平,采用Design-Expert 8.0.6软件,根据Box-Behnken试验设计原理,以总黄酮得率为响应值,固定料液比(g/mL)为1∶20,乙醇体积分数为40%,对超声功率、超声时间、微波功率和微波时间进行四因素三水平的响应面设计试验,试验设计因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表

1.3.5黄芪总黄酮体外抗氧化活性测定

结合参考文献[16-17]稍作改进,在最优试验条件下制备黄芪总黄酮提取液,并进行黄酮浓度测定。用40%乙醇溶液进行稀释,制备0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/mL的样品溶液。

1.3.5.1 DPPH·自由基清除能力测定

取不同浓度样品溶液各2 mL,分别加入0.2 mmol/mL的DPPH溶液2 mL,暗处静置,充分反应30 min,于517 nm处测定吸光度为Ay;相同条件下用无水乙醇代替DPPH溶液,测得吸光度为Az;相同条件下用无水乙醇代替样品溶液,测得吸光度为Ax。以维生素C标准品为阳性对照,浓度与样品一致。DPPH·自由基清除率= [1-(Ay-Az)/Ax]×100%。

1.3.5.2 ABTS·自由基清除能力测定

取7 mmol/L的ABTS溶液20 mL和140 mmol/L过硫酸钾溶液352 μL混合,室温、避光条件下静置过夜,制成ABTS·自由基储备液。取不同浓度样品溶液各0.6 mL,加入2.4 mL ABTS·自由基储备液,混合均匀,在35 ℃水浴加热40 min,取上清液在波长734 nm处测定吸光度Ai。相同条件下用无水乙醇代替ABST储备液,测得吸光度Aj;相同条件下用无水乙醇代替样品,测得吸光度Ao。以维生素C标准品为阳性对照。ABST·自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100%。

1.3.5.3 羟基自由基清除能力测定

取不同浓度样品溶液各2 mL,向其中分别加入6 mmol/L的FeSO4溶液、6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、6 mmol/L H2O2溶液混合溶液各1 mL,充分反应,在37 ℃的恒温水浴中保持30 min。于 510 nm 处测定其吸光度为A1;相同条件下用无水乙醇代替H2O2,测得吸光度为A2;相同条件下用无水乙醇代替样品溶液,测得吸光度为A0;以维生素C标准品为阳性对照。羟自由基清除率= [1-(A1-A2)/A0]×100%。

1.3.6黄芪总黄酮体外抑菌活性测定

1.3.6.1 抑菌活性测定

采用滤纸片法测定。挑取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌斜面菌种,无菌操作培养活化,制成109CFU/mL的菌悬液。按照无菌操作浇筑平板,涂布菌液;用无菌镊子将浸有不同浓度(0.2、0.4、0.8 mg/mL)的圆滤纸片(直径6.0 mm)放入含菌区域内,以40%乙醇溶液为空白对照,平板倒置于37 ℃恒温培养箱中培养18 h后,测量抑菌圈直径,根据抑菌直径的大小,初步判定黄芪总黄酮提取液的抑菌效能。

1.3.6.2 最小抑菌浓度(MIC)测定

对倍稀释法制备不同浓度梯度(0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5 mg/mL)的黄芪总黄酮提取液,取不同浓度样品溶液1 mL加入无菌平板中,与19 mL培养基混合,静置凝固后,加入0.1 mL菌悬液,以40%的乙醇溶液为对照,于37 ℃恒温培养箱中培养18 h后,观察三种菌的生长情况,出现无菌生长的最低浓度判定最小抑菌浓度。

1.3.7数据统计及分析

试验重复3次,均取得相似结果,数据结果表示为平均值±标准偏差。采用Design-Expert V8.0.6软件进行响应面试验分析;采用Microsoft Excel 2010软件进行整理和绘图。

2 结果与讨论

2.1 黄芪总黄酮提取工艺优化单因素试验

2.1.1料液比对黄酮得率的影响

由图1可知,3种方法均在料液比(g/mL)为1∶20时得率最高,其中超声微波联合辅助提取的效果最好,分别比超声辅助和微波辅助高出14.04%和26.87%。当料液比(g/mL)低于1∶20时,随着溶剂用量的增加,黄酮得率上升;当料液比(g/mL)超过1∶20时,随着溶剂用量的增加,黄酮得率逐渐降低。这与周伟等研究结果相似,当溶剂用量过高时,超声微波辐射的能量更多作用于溶剂,而非溶质,从而降低了提取效率[18]。因此,选择最佳提取料液比(g/mL)为1∶20。

图1 料液比对黄酮得率的影响

2.1.2乙醇体积分数对黄酮得率的影响

由图2可知,3种方法中,黄酮得率随着乙醇体积分数的增加均呈现先上升后缓慢下降的变化趋势;当乙醇体积分数低于40%时,随着乙醇体积分数的增加,得率逐渐升高;在乙醇体积分数为40%时,得率均达到最大值,其中超声微波联合辅助提取更具优势,得率达到2.50%,分别比超声辅助和微波辅助高出13.45%和28.77%。根据极性相溶原理,黄芪黄酮与40%的乙醇极性相近[19],而高浓度的乙醇溶液也会导致脂溶性物质的溶出增加,影响黄酮类物质的溶解。故在响应面试验中选择30%～50%的乙醇溶液为优化参考范围。

图2 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

2.1.3超声功率对黄酮得率的影响

由图3可知,在超声功率较低时,随着超声功率的增加,黄酮得率逐渐上升,并在500 W时达到最大值,约为2.69%,当超声功率超过500 W,得率下降。有研究表明,超声波的振动作用和空化效应有助于组织细胞的变形和破壁,从而促进了相应物质的溶出;随着超声功率的增加,一方面溶液中产生了过多的气泡,影响了超声波的传导,另一方面较强的超声波也促进了其他物质的溶出,导致总黄酮得率下降[20-21]。故选择超声功率400 W、500 W、600 W进行响应面优化试验。

图3 超声功率对黄酮得率的影响

2.1.4超声时间对黄酮得率的影响

由图4可知,随超声时间的延长,黄酮得率呈先上升后下降的变化趋势,在20 min时,达到最大值,约为2.62%。这与前人相关研究结论相似,超声时间较短,黄酮类物质不能充分溶出,超声时间过长,溶液温度升高,导致热敏类黄酮物质被氧化结构改变[22],影响得率。因此,确定最佳超声时间为20 min。

图4 超声时间对黄酮得率的影响

2.1.5微波功率对黄酮得率的影响

由图5可知,微波功率低于250 W时,随微波功率的增加,黄酮得率逐渐提升;当微波功率为250 W时,得率达到最高值,约为2.77%;当微波功率超过250 W时,黄酮得率逐渐降低。这是由于微波具有较强的穿透力,可以导致细胞壁破裂,加速细胞内物质溶出,而较高的功率会使温度在较短的时间内迅速提升,导致料液比发生变化,从而影响黄酮得率[23]。因此,确定最佳微波功率为250 W。

图5 微波功率对黄酮得率的影响

2.1.6微波时间对黄酮得率的影响

由图6可知,微波时间低于50 s时,随微波时间的增加,黄酮得率逐渐提升;当微波时间为50 s时,得率达到最高值,约为2.90%;当微波时间超过50 s时,黄酮得率逐渐降低。结合生产实际和经济效益,选择微波时间为40、50、60 s作为响应面参数。

图6 微波时间对黄酮得率的影响

2.2 黄芪总黄酮提取工艺优化响应面试验

2.2.1响应面设计试验结果

根据单因素试验结果和极差分析,确定料液比(g/mL)为1∶20,乙醇溶液体积分数为40%,以黄酮得率(Y)为响应值,选择对黄酮得率影响显著的4个因素,包括超声功率(A)、超声时间(B)、微波功率(C)、微波时间(D),进行四因素三水平的响应面优化设计试验,29个试验组最终结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果

2.2.2模型建立与方差分析

采用Design-Expert V8.0.6软件对表2数据进行回归拟合,得到二次多项式回归模型:Y=3.08+0.16A+0.18B-0.16C+0.073D-0.21AB-0.16AC+0.11AD-1.07BC+0.063BD-0.39CD-0.49A2-0.49B2-0.80C2-0.51D2,回归模型方差分析见表3。

表3 二次多项式模型方差分析

2.2.3交互作用分析

响应面越陡峭,等高线越扁,表明两个独立变量的交互作用越强,对响应值影响越显著[24]。由图7可知,响应面陡峭顺序:CD>AB>AC>AD>BC>BD,即微波功率与微波时间交互作用响应面最陡峭,对黄酮得率影响最大。该结果与表3中方差分析结果一致,即响应面图与P值结果一致,对黄酮得率影响一致。

图7 各因素交互作用的响应面图

2.2.4最优工艺确定及验证

通过响应面模型预测提取黄芪总黄酮的最佳工艺条件为:超声功率517.35 W,超声时间21.70 min,微波功率241.81 W,微波时间51.64 s,在此条件下,黄酮得率预测值为3.13%。结合生产实际条件和经济效益,调整最佳工艺条件为超声功率517 W,超声时间22 min,微波功率242 W,微波时间52 s,在此条件下,经3次平行验证试验,得到实际黄酮得率为(3.21±0.22)%,与预测值接近,说明模型能指导黄芪总黄酮提取。

2.3 黄芪总黄酮体外抗氧化活性分析

2.3.1DPPH·自由基清除能力测定

由图8可知,随着质量浓度的增加,黄芪总黄酮和维生素C的DPPH·自由基清除率均逐渐增强,在质量浓度为0.4mg/mL时达到最大值,分别为87.25%、93.57%,此时黄芪总黄酮的清除能力略低于维生素C,约为其93.25%,说明黄芪总黄酮具有较强的抗氧化活性。

图8 黄芪总黄酮对DPPH·自由基清除率的影响

2.3.2ABTS·自由基清除能力测定

由图9可知,黄芪总黄酮和维生素C对ABTS·自由基的清除率随着质量浓度的增加而增强,并在0.4 mg/mL时达到最大值,分别为89.71%和91.65%,黄芪总黄酮的清除能力略低于维生素C,约为其97.88%,说明黄芪总黄酮具有良好的抗氧化活性,且其活性随浓度升高而增强。

图9 黄芪总黄酮对ABTS·自由基清除率的影响

2.3.3 羟基自由基清除能力测定

由图10可知,黄芪总黄酮和维生素C对羟基自由基清除率与质量浓度正相关,当质量浓度为0.4 mg/mL时清除率达到最大值,分别为87.98%和92.80%,此时黄芪总黄酮的清除能力略低于维生素C,约为其94.81%,说明黄芪总黄酮具有良好的抗氧化活性。

图10 黄芪总黄酮对羟基自由基清除率的影响

2.4 黄芪总黄酮体外抑菌活性分析

黄芪总黄酮对三种菌的抑菌活性测定结果见表4,最小抑菌浓度测定结果见表5。黄芪总黄酮提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有抑制作用,且随黄酮质量浓度的增加,抑菌效果增强。黄芪总黄酮提取物对三种菌的MIC分别为:大肠杆菌0.1 mg/mL,金黄色葡萄球菌0.2 mg/mL,枯草芽孢杆菌0.05 mg/mL。试验结果说明,黄芪总黄酮对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最佳,大肠杆菌次之,最后是金黄色葡萄球菌。

表5 黄芪总黄酮最小抑菌浓度(MIC)

3 结论与展望

本试验结果表明,采用超声微波联合辅助技术提取黄芪总黄酮,比单独使用超声或微波辅助提取效果好。以黄芪总黄酮得率为评价指标,通过单因素和响应面优化试验,确定了超声微波联合辅助黄芪总黄酮的最佳工艺为:料液比(g/mL)1∶20,乙醇体积分数40%,超声功率517 W,超声时间22 min,微波功率242 W,微波时间52 s,在此条件下,经三次平行验证试验,黄酮得率为(3.21±0.22)%。各因素对黄酮得率影响程度的大小依次为超声时间、超声功率、微波功率、微波时间、料液比、乙醇体积分数。黄芪总黄酮具有良好的体外抗氧化活性,质量浓度为0.4 mg/mL时,对DPPH·、ABTS·和羟基自由基的清除率分别为87.25%、89.71%、87.98%。黄芪总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有抑制作用,最小抑菌浓度MIC分别为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.05 mg/mL,对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最佳。

本试验工艺所需提取时间较短,不仅提高了黄芪总黄酮得率,减少了资源浪费,而且节省了大量溶剂和能源消耗,符合“双碳”战略理念,有助于相关企业降低生产成本、提高经济效益,为促进黄芪资源的综合利用,开发黄芪黄酮类药品、保健品、食品、食品调味品、化妆品等提供了重要的数据支撑和方法学依据。