发光细菌测试水质生物毒性影响因素研究

◇天津市环鉴环境检测有限公司 宋静静

天津市生态环境监测中心 巩元帅

在水质监测中，发光细菌法测定生物毒性，操作简单、反应快速，该方法广泛应用于毒性检测。本文分析了盐度、温度、pH、溶解氧、反应体系、菌液状态、表征方式及拟合模型等因素对发光细菌法测定生物毒性的影响，以期为发光细菌法测定水质生物毒性提供参考。

在我国水环境保护工作中，评价江、河、湖泊等各类水体水环境健康程度，主要依靠常规理化监测分析方法，虽然通过理化监测在主要污染物浓度评价及总量控制方面取得了显著成效，水质得到了明显改善，但在以生物监测为主的水生态环境健康方面，国内尚未在水生态环境保护工作中深入开展这项工作。目前，在环境健康监测中采用的生物监测技术主要包括人体内暴露监测、遗传毒性监测及生物毒性监测，其中，生物毒性监测技术被广泛应用于各国家环境污染评价中[1]。

生物毒性监测是基于生态毒理学研究有毒有害物质对微生物、植物、动物等损害情况的监测方法，可以实现分子、细胞、个体等不同水平的毒性检测[2]。根据不同生物检测原理，水环境安全监测中常用的毒性检测方法有鱼法、水蚤法、藻法、发光细菌法以及微生物燃料电池法等[3]。在微生物毒性检测中，发光细菌法应用最为广泛，且国内现行的标准规范GB/T 15441也选用此方法。因此，为更好地利用发光细菌法测试生物毒性，本文总结分析了发光细菌法的主要影响因素，以期为水质生物毒性监测提供参考。

1 环境因素

1.1 盐度

发光细菌在生长过程中，所处环境需要保持一定的盐度，超过或低于临界值，则会影响细菌生长代谢，抑制细菌活性。对于青海弧菌等淡水发光菌，在检测水质毒性时，水样采集后可直接测定，不需要调整溶液盐度；费氏弧菌等海洋发光菌，则需要在测定条件下加入一定量的盐分。罗巅辉等[4]在海洋费氏弧菌培养条件的研究中，对费氏弧菌生长的盐度进行了探索，实验结果显示，盐度在1%-5%期间菌株生长较好；余露军等[5]在费氏弧菌急性毒性微孔板检测方法优化实验中，盐度控制在1.5%-3.5%最适宜费氏弧菌生长，活性较高。

1.2 温度

发光强度与发光细菌活性的影响，主要是由于细胞壁、细胞膜、核酸及蛋白质等物质的活性随温度变化而改变，低温活性降低，高温则会发生变性、凝固，导致活性消失。赵洋甬等[6]研究了活化温度对费氏弧菌发光的影响，结果表明环境温度需控制在10℃-25℃之间。此外，同一温度条件下，培养时间不同，细菌的发光强度也不相同。陈水松等[7]在3%NaCl条件下测试了20℃、25℃、30℃三个温度梯度下细菌发光强度，在25℃条件下费氏弧菌培养15-22h发光度高且稳定。

1.3 pH

在毒性测试时，主要在于改变细胞膜电荷和营养物的离子化程度，进而改变细胞的活性。研究表明，当水样pH控制在6-9之间时，即pH不超标的情况下，发光细菌的发光强度基本不受pH的影响，无需调节水样pH值。当研究特定物质毒性时，在不同pH条件下其分子电离形态不同，毒性随着pH的变化而变化，须根据监测需要，调节水样pH值。铜、铅等重金属随着pH的升高而增大[7]，苯酚类化合物毒性随着pH的升高而减小[8]。

1.4 溶解氧

发光细菌细胞内生命代谢所引起的各种生物化学反应伴随着物质的氧化及还原，因此水体中须保持一定的含氧量。费氏弧菌等发光细菌作为好氧菌，须要有氧分子的参与[9]。在毒性测试过程中，溶解氧浓度需要大于3.0mg/L[10]。为减小溶解氧对发光细菌发光强度的影响，可通过搅拌等方式来增加溶解氧含量。

2 样品处理方式

2.1 反应体系

在利用发光细菌测试样品生物毒性前，需要确定实验反应体系即菌液与样品反应比例，以保证每次监测结果的可比性。国内大多按照菌液与溶液总体积1:10反应体系[11-12]进行测试，也有学者对不同比例反应体系进行了比较。余露军等[5]在研究在微孔板发光测定中比较了硫酸锌对1:1、1:5、1:10等不同反应体系半数抑制浓度EC50的影响，实验结果表明，反应体系1:10时费氏弧菌毒性效应最强，且测试结果变异系数相对较小，此外由实验结果可以看出，反应体系比值越大，测得的EC50浓度越高。

2.2 菌液状态

发光细菌测试水样时，无论是利用冻干粉还是新鲜培养液制备菌悬液，在加入样品测试前，需要保持良好的菌液活性，以提高生物毒性测试的灵敏度和准确度。目前，用于测量菌液活性的检测方法主要有发光强度检测法和吸光度法。对于菌液发光强度，在标准物质测量时变化范围在20%-80%之间，则认定菌液活性好，测定结果有效[10]。吸光度法则是通过测定光密度值，指示菌体细胞密度来反映菌种活性。王娜等[13]以600nm处紫外吸收光度值（OD600）表征菌密度，分别测定了不同化学物质的急性生物毒性，结果表明菌悬液OD600控制在2.0左右时，检测灵敏度最高。

3 结果处理

3.1 结果测定

有毒物质对发光细菌的毒性效应主要体现在对细菌发光强度的抑制，虽然在实验中使用的发光细菌菌液是混匀的悬浊液，但随着时间推移，受环境因素及发光菌自身代谢影响，菌液的发光变化情况也不完全一致，测定发光强度时易引起误差，因此提高细菌发光测定准确度尤为重要。马勇等[11]在发光强度测定过程中，利用发光菌空白发光强度与原始发光强度的比值来校正测定结果，并与传统方法进行了比较，结果表明在计算当量苯酚浓度时线性相关系数优于传统方法。

3.2 表征方式

在发光细菌生物毒性测试中，基于发光强度测试结果的毒性表征方式主要有EC50、最低无效应稀释度、当量氯化汞或苯酚浓度、发光抑制率等。前两种表征方式欧美国家应用较多，强调无毒或低毒效应，国内则主要采用当量氯化汞或苯酚浓度、发光抑制率等，用于反映污染物风险[14]。孙成华等[15]在污染源监测中对不同表征方式进行了探讨比较，结果表明对于发光抑制率小于60%且无法求出EC50的水样，采用当量毒性参照物浓度表征，对大于60%的水样，采用最低无效应稀释度表征更直观可靠。

4 结束语

在生物毒性监测中，发光细菌法与其他生物监测方法相比，具有快速、简单、灵敏的特点，但发光细菌作为微生物，在测定过程中容易受到扰动，从而影响测定结果，因此在以后的应用中，还需做好以下几方面工作：①在菌液培养中，优先选择品质好的菌种，减小菌液本身产生的误差；②根据菌液活性剂存储时间，在监测过程中发现菌液活性不满足要求时，及时进行更换；③在数据拟合模型应用中，研究非线性模型数据拟合方法，提高监测结果准确性。

随着“十四五”期间水生态评价及生物多样性评价的日益关注，生物监测已成为水环境质量监测的发展方向，生物毒性监测作为生物监测的一种，在评价水体水质安全中得到了广泛应用。利用生物毒性监测数据，结合其他水质及生物监测指标，建立水生态评价体系开展评价将是水生态环境管理发展的重点方向。