单克隆抗体类生物制品关键质量属性

景荣先 曾 媛 张国林

1.南京医科大学附属苏州医院 苏州市立医院药学部，江苏苏州 215002；

2.辉瑞 （中国）研究开发有限公司中国药物研发部临床药理部，上海 201203；

3.苏州市药品检验检测研究中心，江苏苏州 215104

单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）已成为抗肿瘤治疗领域发展最为迅猛的生物药类型[1-2]。目前已批准上市的治疗性mAb 类药物有70 余种，结构多为两条重链和两条轻链经二硫键和非共价键联合形成的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）大分子。mAb 类药物抗原表位、理化性质和生物活性均一性程度较高，能特异性与靶标分子结合，免疫原性低，患者耐受性好。但由于其分子量大、立体结构复杂，在生产、纯化、贮存和运输等过程中易产生变异体，影响药物的安全性、有效性、稳定性和生物学活性，甚至产生免疫原性导致严重后果[3-4]。

程序性死亡受体-1（programmed cell death protein 1，PD-1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等都是mAb 药物的靶点[5-6]。肿瘤细胞高表达细胞程序性死亡-配体1/2（programmed cell death ligand 1/2，PD-L1/L2），抑制T 细胞功能，导致肿瘤细胞无法被杀灭，而PD-1 mAb 药物可以阻断这一通路，恢复T 细胞功能，使免疫细胞继续杀伤肿瘤细胞。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）参与多种恶性肿瘤的发生和细胞迁移、凋亡过程，是肿瘤治疗的关键靶点之一。随着临床需求的增加和抗VEGF mAb 原研药（安维汀）专利到期，国内相关生物类似药贝伐珠单抗的研发如火如荼，并已有9 个品种获批。目标产品质量概况（quality target of product profile，QTPP）是产品质量属性的前瞻性总结和预期目标，是与产品质量、安全和有效性相关的质量属性。质量属性可分作关键的和非关键的：质量属性是否作为关键质量属性（critical quality attributes，CQAs）主要通过评价其超出可接受范围时对产品安全性和有效性的影响程度[7-8]。

研究mAb 类生物制品CQAs、分析其杂质检测结果准确可靠的影响因素对产品治疗控制和临床用药安全具有重要的价值。

1 单抗类药物的CQAs

CQAs 是mAb 类药物符合预期用途的关键属性，通常根据产品特点及QTPP 方面切入分析。mAb 的CQAs 主要包括等电点、单体、大小变异体、电荷变异体、N-糖基化修饰、唾液酸含量、生物学活性等，是影响药品安全性和有效性的重要指标。CQAs 与产品的高级结构、生物活性及免疫原性等均密切相关。单体是PD-1 mAb 药物的作用基础，分子大小变异体是最常见的变异体类型，也是影响抗体稳定性的关键因素。分子大小变异体影响抗体的活性和效价，使蛋白单体浓度降低，增加药物的免疫原性。鉴定分子大小变异体的种类，分析其形成的机制和对产品质量的影响并采取适当控制措施是单抗类产品整个生命周期中都需要关注的问题。分子大小变异体包括高分子量变异体（high molecular weight，HMW）和低分子量变异体（low molecular weight，LMW）。前者主要是mAb 药物发生聚合形成二聚体或多聚体形成的，后者是由于mAb 药物发生降解或分子发生断裂形成低分子量蛋白造成的。分子大小变异体随时间变化率可提供聚体的功能特征，且对应着mAb 药物产品的有效期。

1.1 电荷异质性

电荷异质性是mAb 药物变异体的另一类型[9]。细胞培养条件变化、纯化工艺及产品储存条件变化等均会引起mAb 药物电荷异质性。mAb 药物电荷异质性会影响单抗的稳定性，对其功能和组织分布及药代动力学均有明显的影响。电荷变异体分析是mAb 药物质量控制的重要参数。酸性变异体与碱性变异体是mAb 药物电荷变异体的主要类型，其中门冬酰胺脱酰胺和糖化修饰是酸性变异体的常见来源。

1.2 等电点（isoelectric point，pI）

等电点是反映mAb 电荷异质性的关键指标，可体现药物电荷与空间构象的均一性[10]。采用等点聚焦电泳（iso-electric focusing，IEF）分析时，酸性变异体的表观pI 小于抗体主峰，而采用阳离子交换色谱（cation exchange chromatography，CEX）分析时，酸性变异体的保留时间小于抗体主峰。mAb的C 端发生Lys 修饰及N 端谷氨酰胺的不完全环化是碱性变异体的主要来源。门冬氨酸异构化及甲硫氨酸氧化也是碱性变异体的重要原因。采用IEF 分析时，碱性变异体的表观pI 大于抗体主峰，而采用CEX 分析时，碱性变异体的保留时间大于抗体主峰。mAb 药物电荷异质性分析可以作为批间一致性评价的参考指标，也可通过分析电荷的分布情况监测整个生产工艺流程，推动产品生产工艺的优化。mAb 药物电荷变异体的检测技术主要包括离子交换色谱（ion exchange high performance liquid chromatography，IEX-HPLC）、毛细管等电聚焦电泳（capillary iso-electric focusing， cIEF）和全柱成像毛细管等电聚焦电泳（imaging capillary electrofocusing electrophoresis，iCIEF）等[11-15]。

mAb 药物变异体的产生是一个动态过程，分析引起变异体的因素并采取应对措施可以有效降低变异体的发生率。分析变异体随时间变化的趋势并采取措施对产品实施质量控制比检测终产品变异体更为重要，而揭示单抗类产品容易发生聚集的机制，并从产品设计和工艺改进以降低变异体的发生比分析变异体的时间变化趋势更重要。

1.3 糖基化

大部分mAb 是由中华仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells，CHO）表达系统生产的。mAb生产过程中易受到各种内外部因素影响而发生翻译后修饰（post-translational modification，PTM）而产生变异体影响mAb 的稳定型和与目标抗原的结合活性，并可能产生免疫原性。糖基化（glycosylation）和糖化（glacation）修饰是最常见的PTM 类型[16-17]。糖化为非酶促化学修饰反应，主要是还原糖（葡萄糖、半乳糖等）的醛基与生物大分子（核酸、蛋白质等）的伯氨基发生缩合反应形成Schiff 碱，进一步发生Amadori 重排并形成稳定的共价键的状态。在抗体药物中，糖化主要发生在重链互补决定区3 的Lys 上。糖化是重组抗体药物异质性的重要原因，对该类药物的结构、理化特性和稳定型及安全性造成不利影响。糖基化为酶促化学修饰反应，即在糖基转移酶的作用下，非糖生物大分子与糖共价结合的反应[18]。N-糖基化和O-糖基化是最常见的糖基化连接方式。mAb 的翻译后糖基化修饰会影响药物的稳定型、溶解性和空间结构及生物活性等，也会对该类药物在体内的代谢和分布造成一定的影响。目前，FDA 和EMEA 及中国药典等均要求对mAb 药物的糖化水平进行分析。mAb 的糖基化是其CQAs 之一。N-糖基化和O-糖基化是PD-1 mAb 药物的主要糖基化修饰。N-糖基化即寡糖连接到门冬酰胺上，其经典的保守序列为Asn-AASer/Thr-AA。PD-1mAb 药物上N-糖基化的发生与宿主细胞、培养基组成和培养条件有关。mAb 药物糖化的重链和轻链在还原的十二烷基硫酸钠-毛细管电泳（capillary electrophoresis-sodiumdodecyl sulfate，CE-SDS）表现为峰图展宽，且轻链在紫外光或激光诱导荧光检测可出现肩峰，可用于PD-1 mAb药物的糖型分析。采用常规紫外检测器或荧光检测器的亲水作用色谱和毛细管电泳等是基于标记的糖型分析手段[19-20]。O-糖基化是在糖基转移酶的作用下，在Ser 或Thr 上连接糖链的过程。O-糖基化糖链结构复杂，无典型的核心结构和通用的内切酶，分析难度较大。O-糖基化的分析策略通常是采用β 消除释放O-糖链，对释放的糖链进行荧光标记后进行色谱分离和荧光检测器检测。

1.4 生物学活性

生物学活性是单抗类药物筛选、表征和放行的重要属性，也是稳定性研究的重要指标。虽然仪器分析技术的进步为单抗分子结构的确定提供了新的思路和手段，但其高级结构及其翻译后修饰的研究仍存在诸多局限性。生物学活性分析是分析单抗类生物制品高级结构研究的重要措施。目前，单抗类药物生物学活性分析的方法主要有细胞毒性法、细胞增殖抑制法、补体依赖的细胞毒性法、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性法和报告基因法等[21-26]。生物学活性是反映生物学性质的重要方法，是体现单抗类药物特定生物学效应的量值，是药物高级结构确证的补充，是单抗类药物的关键质量属性之一。

2 小结

mAb 已成为抗肿瘤治疗领域发展最为迅猛的生物药物类型。但由于其分子量大、立体结构复杂，在生产、纯化、贮存和运输等过程中易产生变异体，影响药物的安全性、有效性、稳定性和生物学活性，甚至产生免疫原性造成严重后果。研究mAb 类生物制品CQAs、分析其杂质检测结果准确可靠的影响因素对产品治疗控制和临床用药安全具有重要的价值。

mAb 的CQAs 主要包括等电点、单体、大小变异体、电荷变异体、N-糖基化修饰、唾液酸含量、生物学活性等，是影响药品安全性和有效性的重要指标，与产品安全性和有效性均密切相关。