质谱时代经典微生物鉴定在临床微生物实习教学中的传承与创新

王柏莲 林 青 林慧珍 蒋诚传 廖 瑜 潘慧颖 李泰阶

广西医科大学附属武鸣医院医学检验科，广西南宁 530199

科学技术的发展带动了医学技术的进步，临床微生物学检验经历了漫长的手工鉴定过程，从经典手工鉴定到全自动微生物鉴定再到如今的质谱鉴定时代，实现了革命性的飞跃。广西医科大学附属武鸣医院是武鸣区唯一的一所三级甲等医院，承担着武鸣区内几所医学院校的大专生、本科生的实习带教工作，这些学生毕业后很多就业于基层医院或一些检测仪器设施不够完善的小型医院，大部分基层医院并未配置质谱仪，其检测能力尚待提高，而如何在当今的质谱时代下，让学生既能掌握质谱快速鉴定微生物技术，又能牢固掌握经典微生物鉴定方法（形态学及生理生化学），并利用经典鉴定方法与质谱鉴定技术的结合，提高对苛养菌、厌氧菌和罕见菌的认知，使学生能够从容地走向工作岗位，这是一个值得探索的问题。

1 质谱技术原理以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）技术鉴定微生物为例

微生物的主要生物活性物质是蛋白质和核酸，核酸决定蛋白的表达，蛋白的表达决定生物体表型。基于蛋白质指纹图谱进行的微生物鉴定,相比核酸水平进行的鉴定更为准确和直接[1]。MALDITOF MS 技术通过对微生物蛋白质的解吸分析达到对微生物鉴定和分型目的。其检测原理是基质与微生物蛋白质形成共结晶体，共结晶体在激光照射下，发生解吸和电离，菌体蛋白质发生离子化，带电离子在电场作用下进入飞行时间检测器，离子依质荷比不同而分离，最终在飞行管末端检测到每个离子峰度，形成指纹图谱。通过软件对这些指纹图谱进行处理并和数据库中已知微生物标准图谱进行比对，达到鉴定微生物目的[2]。

2 MALDI-TOF MS技术在微生物鉴定中的优势与局限

近年来，MALDI-TOF MS 是在微生物鉴定领域方面发展迅速的一种新型鉴定技术，不仅对常见病原菌鉴定准确率达95%以上[3]，还能快速鉴定经典方法很难鉴定的苛养菌、厌氧菌、罕见菌等。经典的生理生化鉴定方法对这些生长条件要求高，生化反应不活跃的细菌，很难鉴定到种水平[4]；质谱技术在真菌鉴定方面，特别是对酵母菌的鉴定已成为一种常规的鉴定方法，对丝状真菌的鉴定也取得了一定成效[5]；MALDI-TOF MS 技术凭借其具有简单快速、高效准确的优点，已广泛应用于食品[6]、水产[7]、兽医及临床[8-9]等多个领域的病原微生物鉴定工作，在细菌、真菌和病毒鉴定方面，展现出巨大的应用潜力。但该技术也存在一定的局限性，如质谱技术无法鉴定数据库中没有的菌种、新出现的菌种，另外对混合菌的鉴定还不太准确，直接检测时因细菌浓度不够而不能检出[10]；遗传物质相近的菌种，由于蛋白质指纹图谱接近无法区分，导致鉴定结果存在偏差和误差[11]，如阴沟、神户、霍氏等；质谱技术无法代替需经全面生化反应和血清学试验鉴定分型的细菌，如沙门菌属、志贺菌属等需要经典手工的血清学鉴定作为补充。

3 质谱时代经典微生物鉴定的传承与创新

质谱时代下临床微生物教学面临的现状：由于质谱技术在微生物鉴定中具有高效、快速、准确、经济优势，加上临床工作量大，师资力量不足，带教老师只顾着埋头完成工作，往往忽略了给实习生传授经典的微生物鉴定方法，只有当质谱结果与细菌形态特征不相符时，才会用经典的鉴定方法进行鉴定。学生进入微生物室实习阶段，是理论与实践结合的提升，但是目前由于过度依赖质谱，致使学生在课堂上学到的经典鉴定方法的理论知识未能在临床实践中得到巩固，如何解决目前面临的这个问题？本文从以下几个方面进行探索与实践。

3.1 以形态学为基础，增强学生对常见病原菌的感性认知

细菌形态学检查是细菌重要的鉴定手段之一，通过观察细菌镜下形态染色特点和平板上菌落特征，可以为后续的检验提供参考依据，对少数具有典型特征的细菌可以进行初步诊断[12]。临床微生物待测标本在完成检测前涉及多个岗位环节，包括标本核收、接种、涂片阅片、分离鉴定、药敏试验、结果报告等。学生轮转到分离鉴定岗位时，带教老师会带领学生对前一天接种的平板进行判读，挑选出可疑菌落进行鉴定。带教老师采用以提问题为基础的启发式教学模式[13]，引导学生识别临床标本可疑致病菌在不同平板上的菌落特征及其染色特点。如：血平板上菌落形成“脐窝状”的细菌怀疑什么细菌？为什么会有“脐窝状”？血平板上有生姜气味、产生金属光泽的菌落怀疑什么细菌？麦康凯平板适合哪类细菌生长？为什么有些菌落是红色，有些菌落是无色透明？通过提问式、启发式教学模式引导学生对临床常见病原菌的菌落形态特征有初步的感性认识，对于不常见和不认识的可疑菌落做重点标记，等待质谱鉴定结果再决定下一步的鉴定步骤。

3.2 生化反应是框架，由点到面构建细菌知识体系

3.2.1 基于触酶试验构建革兰氏阳性菌知识体系 革兰氏阳性病原性球菌是一类主要引起化脓性感染的球菌。临床常见主要包括葡萄球菌属、链球菌属和肠球菌属。挑选出的可疑革兰氏阳性病原性球菌通过触酶试验由点到面进行拓展。通过触酶试验把革兰氏阳性球菌分成触酶阳性的葡萄球菌属和触酶阴性链球菌属、肠球菌属两大类。通过七叶苷、胆汁七叶苷试验鉴别出链球菌属和肠球菌属；利用杆菌试验、Optoeh 试验、CAMP 试验鉴别出化脓性链球菌、肺炎链球菌、B 群链球菌；进行血浆凝固酶试验，鉴定葡萄球菌的致病性。金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，是葡萄球菌属中致病力最强的。鉴定出金黄色葡萄球菌后，可以进一步做能够初步鉴定流感嗜血杆菌的“卫星试验”。通过由点到面、触类旁通进行拓展，把革兰氏阳性病原性球菌的生化鉴定要点高度概括总结，梳理出脉络清晰的鉴定思路，使学生系统、牢固地掌握革兰氏阳性病原性球菌经典鉴定方法。

3.2.2 基于氧化酶、氧化发酵实验构建革兰氏阴性菌知识体系 革兰氏阴性杆菌是临床最常见的病原菌之一，是泌尿道、呼吸道、肠道、腹腔和盆腔等常见病原菌。革兰氏阴性杆菌鉴定是否准确，对选择正确的药敏鉴定板条非常重要。面对种类繁多的革兰氏阴性杆菌，怎样才能达到正确鉴定的目的？从培养学生正确的鉴定思路着手，通过关键性试验进行细菌的大致分类。对于挑选出的可疑革兰氏阴性杆菌病原菌，可通过氧化酶试验和葡萄糖氧化发酵试验把革兰氏阴性杆菌分成三大类：一是肠杆菌科细菌，氧化酶阴性、发酵葡萄糖；二是非发酵菌，氧化酶阳性（不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌除外），不发酵葡萄糖；三是氧化酶既阳性又发酵葡萄糖的弧菌属、气单胞菌属和邻单胞菌属。肠杆菌科细菌又可以根据苯丙氨酸脱氨酶和葡萄糖酸盐试验分为三大类：一是苯丙氨酸脱氨酶和葡萄糖酸盐试验阴性的肠杆菌科细菌；二是苯丙氨酸脱氨酶阴性，葡萄糖酸盐阳性的肠杆菌科细菌；三是苯丙氨酸脱氨酶阳性，葡萄糖酸盐阴性的肠杆菌科细菌。通过关键性试验对细菌进行鉴定分类，使学生对种类繁多的革兰氏阴性杆菌进行生化鉴定时，沿着氧化酶试验和葡萄糖氧化发酵试验这条主线，达到思路清晰、触类旁通的效果，不至于面对种类繁多的革兰氏阴性杆菌，感到无所适从。

3.3 血清学是补充，快速诊断病原菌

质谱技术鉴定无法代替血清学，血清学试验是质谱鉴定技术的有效补充。需经全面生化反应和血清学试验进行分型的细菌如沙门菌属、志贺菌属、霍乱弧菌，致病性大肠埃希菌等，质谱只能鉴定到属水平，必须进行经典手工的血清学鉴定才能进行分型和保证鉴定结果的准确性。比如质谱鉴定出沙门菌属，须用沙门菌A ～F 多价血清做玻片凝集试验，凝集后进一步作O 抗原、H 抗原进行分型。对这些可引起人与人之间的传播的病原菌，质谱的快速鉴定加上血清学的有效补充，可以快速诊断病原菌，这对控制传染病的传播具有重要意义，并为临床感染性疾病的快速准确诊断和有效治疗提供方案[14]。

3.4 关键生化反应结合质谱鉴定技术的应用

质谱鉴定是对微生物的蛋白质进行分析，核酸决定蛋白的表达，遗传物质相近的菌种检测结果会存在一定的误差，因此需要关键生化反应加以鉴别。例如SS 平板上志贺菌与不发酵乳糖或缓慢发酵乳糖的大肠埃希菌，菌落形态相似，志贺菌抗血清有交叉反应，质谱鉴定为大肠埃希菌，四种多价血清凝集，可用关键生化反应醋酸钠试验鉴别出来。临床常见的肠杆菌属细菌，如阴沟肠杆菌、神户肠杆菌、阿氏肠杆菌、霍氏肠杆菌，其蛋白峰十分接近，质谱无法区别出来，因此可利用两个关键生化反应V-P 试验和蜜二糖试验进行鉴别。

3.5 借助质谱鉴定技术建立罕见细菌菌种库，提高学生对苛养菌、厌氧菌和罕见菌的认识

阅板时遇到不常见、不认识的可疑菌落，借助质谱鉴定结果，查阅相关资料和文献，通过外送菌株进行16s RNA 测序确证后[15]，实验室建立本室罕见细菌库目录。微生物实习期一般为6 ～8 周，实习生在实习期内无法获取一些罕见细菌的标本，导致对某些罕见、苛养菌缺少直观认识[16]。带教老师可以通过罕见细菌库目录挑选出需要教学的细菌，在带教老师的指导下由学生进行培养，通过培养鉴定让学生掌握罕见菌的菌落特征、染色特点、生化特性、耐药特点，提高实习生专业实践能力。质谱技术的发展在当今实习带教中发挥了重要的作用，为学生认识和学习苛养菌、厌氧菌和罕见菌提供了有利机会，同时借助质谱技术，建立实验室罕见细菌菌种库，可实现对当代学生的创新性教学。

4 小结

临床微生物实习生在实习阶段是深化理论知识、提升专业实践能力的关键阶段。在质谱快速鉴定微生物时代下，把质谱快速鉴定与经典的微生物鉴定贯穿于病原体鉴定的教学过程中，使学生既能掌握先进质谱快速鉴定新技术，并在质谱技术指导下掌握苛养菌、厌氧菌和罕见菌的菌落形态特征、染色特点、生化特性，又能够熟练掌握经典手工鉴定方法，以便更好地适应各级医院微生物实验室的工作需要。