桔霉素分子印迹预组装体系的量子化学模拟及吸附性能研究

周康熙，吴 俐，吕旭聪，倪 莉*

（1 福州大学石油化工学院 福州350108 2 福州大学食品科学技术研究所 福建省食品生物技术创新工程技术研究中心 福州 350108）

真菌毒素桔霉素（Citrinin，CIT）是一种由青霉或曲霉产生的聚酮类次级代谢产物[1]，对生物体内多种脏器具有毒性[2-4]，因此桔霉素的检测对于该类发酵食品的安全性评估尤为重要[5]。当前桔霉素的检测方法有高效液相色谱法（HPLC 法）[6]、荧光分光光度法[7]、免疫分析法[8]等，其中HPLC 法是检测桔霉素最为常用的方法，也被多个标准所使用。由于桔霉素的限量较低，因此当前对于痕量浓度的样品仅靠HPLC 的分析检测略显不足[9]。桔霉素新国标GB 5009.222-2016《食品安全国家标准食品中桔青霉素的测定》 是在旧国标GB/T 5009.222-2008《红曲类产品中桔青霉素的测定》的基础上进行改进，在样品前处理阶段增加了免疫亲和柱净化操作，能够起到除杂和富集的效果，其定量限由1 mg/kg 改进至80 μg/kg，提高了检测灵敏度，然而免疫亲和柱的成本较为高昂[10]，因此有必要开发一种低成本的替代方法。

分子印迹技术使用化学合成方法人为构建具有特殊识别位点的聚合物（分子印迹聚合物，Molecular imprinted polymer，MIP），该聚合物能够模拟抗体对抗原的识别功能，在特异性吸附的基础上实现对目标物的分离纯化或分析检测[11-12]。MIP 常用的构建方法是：以目标物为模板分子，将具有聚合作用的功能单体与模板分子之间进行共价或非共价结合，再加入交联剂和引发剂对功能单体进行交联聚合，最后将模板分子洗脱，从而形成对目标物具有吸引力的多孔穴印迹聚合物[13-14]。当前已有基于分子印迹技术开发用于桔霉素的提纯或检测的固相萃取柱（Solid phase extraction column）的报道[15-16]。在构建桔霉素分子印迹聚合物时，洗脱溶剂无法完全清除聚合物深层的模板分子，在痕量分析时可能会发生模板泄露[17]。为避免模板泄露带来的检测失准问题，需要使用与目标物结构相似的假模板[18-19]。然而，当前缺乏桔霉素与假模板分子的同时检测方法，在预组装桔霉素分子印迹聚合物时挑选功能单体也较为盲目，不利于快速构建桔霉素分子印迹聚合物。

基于此，本文以1-羟基-2-萘甲酸（1-Hydroxy-2-naphthoic acid，1H2NA）为假模板分子，构建同时检测CIT 和1H2NA 的方法，基于量子化学计算方法筛选桔霉素分子印迹聚合物的功能单体，用响应面优化该聚合物的最佳组装工艺，同时分析该聚合物对桔霉素的吸附性能，旨在为分子印迹聚合物的构建和桔霉素富集与检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

功能红曲（Fermentum Rubrum）FHQ2 取自福建宁德；CIT（色谱纯级），上海源叶生物科技有限公司；1H2NA、2，6-二氨基吡啶（2，6-Diaminopyridine，2，6-DAP）、甲基丙烯酸（Methacrylic acid，MAA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（Ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）等试剂（分析纯级），阿拉丁试剂（上海）有限公司；磷酸、三乙胺、四氢呋喃等试剂（分析纯级），国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯级），德国默克公司；桔霉素免疫亲和柱，美国VICAM 公司。

1.2 仪器与设备

Ultimate 3000 UHPLC 液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；RE-52AA 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；ZWY-2102C 型摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；DLSB-5/10 低温冷却循环泵，予华仪器有限责任公司；V-100 型步琦真空泵，瑞士BUCHI 有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 CIT 和1H2NA 的同时检测

1.3.1.1 标品的配置 以75%乙醇为溶剂，配制成同时含有500 ng/mL 的CIT 和4 000 ng/mL 的1H2NA 的混标母液，将母液与75%乙醇分别按1∶4、2∶3、3∶2、4∶1 的体积比稀释成不同质量浓度梯度的标品溶液。

1.3.1.2 样品的处理 对于分子印迹样品，取分子印迹聚合物清洗液或者吸附试验的样品于12 000 r/min 离心5 min，取上清液用0.22 μm 滤膜过滤后待测；对于红曲样品，取0.5 g 样品加入75%乙醇20 mL，60 ℃提取120 min，4 500 r/min 离心15 min，取上清液经0.22 μm 滤膜后待测。

1.3.1.3 自建液相色谱的检测条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），激发波长331 nm，发射波长500 nm，样品进样量20 μL，流动相：A 相为同时含有0.02%三乙胺、0.32%四氢呋喃和0.1%磷酸的水溶液，B 相为100%的乙腈，流动相的洗脱梯度条件见表1。

表1 HPLC 流动相的梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phase of HPLC

1.3.2 基于量子化学计算筛选功能单体 以1H2NA 为假模板分子，以MAA 等20 个常见的功能单体为对象，用量子化学相关软件优化假模板分子与备选功能单体的最低能量构象图及计算各原子电荷分布，推测其可能的主要质子给出点和电子给出点，初筛合适的功能单体，再将假模板分子与之进行分子对接并优化其结合物的最低能量构象，根据式（1）计算两者之间的结合能（ΔE），以此来筛选适合制备CIT 分子印迹聚合物的功能单体。

式中，EAB——结合物单点能，kJ/mol；n——功能单体数量；EA——功能单体单点能，kJ/mol；EB——模板分子单点能，kJ/mol。

量子化学的计算过程如下：首先使用Gaussian 16 软件在B3LYP/6-31g**em=gd3bj 水平进行优化，并在相同水平做振动分析以确保没有虚频。所有构型的单点能均在B3LYP/def2tzvp em=gd3bj 水平进行。结合构型搜索以及优化采用molclus 软件[20]产生最可能的50 个吸附结构，并使用xtb 软件[21]进行初步优化并进行去除能量重叠，得到能量最低的6 种构型。将6 种构型在B3LYP/6-31g** em=gd3bj 水平进一步优化，在相同水平做振动分析以确保没有虚频，并在B3LYP/def2tzvp em=gd3bj 水平进行单点计算。该部分数据的计算委托中科科翼（北京）科技有限公司代为执行。

1.3.3 分子印迹聚合物的制备 以1H2NA 为假模板分子、2，6-DAP 为功能单体、二甲亚砜为致孔剂、β-环糊精为辅助致孔剂，EGDMA 为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂制备桔霉素分子印迹聚合物MIP1。MIP1 的具体制备步骤与参考文献[22]所述一致。MIP1 的优化指标为1H2NA、2，6-DAP 和EGDMA 添加的物质的量，这三者的初始添加物质的量分别为1，2，2 mmol，单因素优化在此基础上将每种物质添加的物质的量分别替换为1，2，3，4，5，6 mmol，基于单因素优化结果使用Design-Expert V8.0.6.1 软件进行三因素三水平响应面优化。在MIP1 最优合成条件下，以不加1H2NA 的聚合物为NIP1；在MIP1 最优合成条件下，将2，6-DAP 替换为MAA 即得MIP2；在MIP2 制备工艺的基础上不加1H2NA 的聚合物即得NIP2。

1.3.4 聚合物的动态吸附性考察 称取制备好的MIP1、NIP1、MIP2 和NIP2 各0.25 g 分别均匀分散于100 mL 锥形瓶内的30 mL 200 ng/mL 桔霉素溶液中，将各个吸附体系在30 ℃、120 r/min 条件下振荡180 min，从第0 分钟开始每隔30 min 取样1 mL 并迅速进行高速离心（12 000 r/min 离心5 min）和过膜（0.22 μm 滤膜）处理，分析上清液中剩余桔霉素浓度，按式（2）计算不同分子印迹聚合物对桔霉素的吸附载量（Q）。

式中，C0——桔霉素的初始质量浓度，ng/mL；Ct——t 时刻样品溶液中桔霉素质量浓度，ng/mL；V——所取桔霉素溶液的体积，mL；m——聚合物的质量，g。

1.3.5 聚合物的静态吸附性考察 以100 mL 锥形瓶为容器，制备好的聚合物MIP1、NIP1、MIP2和NIP2 每种各准备7 份，每份0.25 g，将每种聚合物分别均匀分散于7 个不同质量浓度梯度（0，100，200，300，400，500，600 ng/mL）的30 mL 桔霉素溶液中，再将各个吸附体系在30 ℃、120 r/min条件下振荡150 min，吸附结束后进行高速离心（12 000 r/min 离心5 min）和过膜（0.22 μm 滤膜）处理，分析上清液中剩余桔霉素质量浓度，按式（2）计算不同分子印迹聚合物对桔霉素的吸附载量（Q）。

1.3.6 聚合物对红曲样品中桔霉素的吸附效果考察 称取0.25 g 制备好的MIP1、NIP1 和MIP1 分别填装于SPE 空柱中，封装后分别加入75%乙醇润湿，直至不再流出液体，向柱子内加入1 mL 样品溶液，收集过滤液直至液体不再流出，将液体12 000 r/min 离心5 min 后过膜用HPLC 绘制图谱。

2 结果与分析

2.1 桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸同时检测方法的构建

在构建分子印迹聚合物时，洗脱溶剂无法将深埋于聚合物内部的模板分子完全洗脱，为避免模板泄露带来的检测失准问题，需要使用与目标物结构相似的假模板。1H2NA 与CIT 分子结构较为相似，均具有荧光显色反应的聚酮环，两者的聚酮环上均具有邻位羟基和羧基，适宜作为CIT 的假模板[16]。对CIT 和1H2NA 同时检测方法的构建有助于同时监测CIT 的吸附与假模板的洗脱。

由图1 可知，新构建的HPLC 检测方法能够将CIT 和1H2NA 相分离，两者峰形良好，不相干扰、不拖尾、标曲线性好（R2＞0.999），能够实现对这2 种质的同时检测。以甲醇对分子印迹聚合物的清洗液为对象，添加一定质量浓度的CIT 作为待测样品，经检测2 种目标物的质量浓度后再做加标回收率试验，加标回收率均在95%～100%之间（表2），说明该方法能为后续CIT 分子印迹聚合物的构建提供检测基础，尤其是检验聚合物对样品吸附过程中是否有模板泄露问题。此外，由于这两种物质结构过于相似，其经过C18 柱的保留时间相差较短（0.48 min），验证了1H2NA 可作为替代CIT 作为分子印迹模板的可行性。

图1 CIT 及1H2NA 的液相色谱图（a）及其标准曲线（b、c）Fig.1 Liquid chromatogram（a）and standard curve（b，c）of CIT and 1H2NA

表2 CIT 和1H2NA 同时检测方法的加标回收率Table 2 The recovery rate of standard addition of the simultaneous detection method for CIT and 1H2NA

2.2 基于量子化学计算筛选功能单体

基于量子化学方法优化假模板分子1H2NA与20 种功能单体的最低能量构象及计算各原子电荷分布，推测其主要质子给出点和电子给出点（表3）。原子电荷大小与其电子交换能力有关，所带负电荷越大，电子越多，越能结合质子；所带正电荷越大，给质子能力越强。虽然所有物质均存在质子给出点和电子给出点，但两者的强度有所差异。相比于1H2NA，4-乙烯基咪唑、苯乙烯、对二乙烯基苯和对乙基苯乙烯主要质子给出点和电子给出点处的电荷较小，对目标物的结合能力较弱；MAA 和2-（三氟甲基）丙烯酸给质子能力虽较强，但给电子能力较弱，2-（甲基丙烯氧基）-N，N，N，-三甲基乙烷-1-胺、烯丙胺、4-乙烯基吡啶、1-乙烯基咪唑、甲基丙烯酸甲酯、2-乙烯基吡啶、N-乙烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯则给质子能力不足，这两类物质与1H2NA 的结合稳定性较低。初步筛选出较为合适的功能单体亚甲基丁二酸、4-乙烯基苯甲酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸、2，6-DAP。

表3 假模板分子与各功能单体的主要质子给出点和电子给出点Table 3 The main proton-giving points and electron-giving points of pseudo-template molecules and functional monomers

以此为基础，再次运用量子化学预测初筛后的功能单体与1H2NA 按物质的量比2∶1 结合后的最低能量构象模拟图（图2），并根据式（1）计算结合能（ΔE）。结合能越高，预组装的MIP 就越稳定。从表4 中可看出，1H2NA 与2，6-DAP 的结合最为稳定，因此选择2，6-DAP 作为功能单体。

图2 假模板分子与备选功能单体的最低能量构象模拟图Fig.2 Simulation diagram of the lowest energy conformation of pseudo-template molecule and alternative functional monomer

表4 假模板分子与备选功能单体的结合能理论计算结果Table 4 Theoretical calculation results of binding energy between pseudo-template molecule and alternative functional monomer

2.3 响应面优化CIT 分子印迹聚合物的合成工艺

模板分子、功能单体和交联剂的添加比例需要均衡，当模板分子比例太低或交联剂比例太高时，可能会形成较多的非印迹空穴，当模板分子比例太高或交联剂比例太低时，可能会导致印迹聚合物结构松散，在研磨或超声处理时其印迹空穴的结构被破坏。以桔霉素吸附载量为指标，采用响应面法优化构建桔霉素分子印迹聚合物所需的模板分子、功能单体和交联剂的最优配比，参考单因素优化结果（图3）3 种物质所选添加物质的量优化范围为1～4 mmol，响应面优化试验方案及结果见表5。

图3 MIP1 组装体系的单因素优化Fig.3 Single factor optimization of MIP1 assembly system

图4 MIP1 组装体系的响应面优化Fig.4 Response surface optimization of MIP1 assembly system

表5 响应面优化桔霉素分子印迹聚合物制备工艺的试验方案Table 5 Test scheme for optimizing the preparation process of citrinin molecularly imprinted polymer by response surface methodology

拟合方程：

Y=-295.01879 +89.62513X1+2.92325X2+220.21301X3+6.09235X1X2-5.61967X1X3-20.96920X2X3-17.31930X12+10.25023X22-28.89983X32

其中，Y——吸附载量，ng/g；X1——假模板分子用量，mmol；X2——功能单体用量，mmol；X——交联剂用量，mmol。

当X1=2.95 mmol，X2=4 mmol，X3=2.07 mmol时，该分子印迹聚合物对桔霉素的吸附载量最大，其理论最大值为190.31 ng/g。经过试验验证，该聚合物对桔霉素的实际吸附载量为（195.10±13.21）ng/g，符合理论模型，相比于优化前【假模板分子用量1 mmol、功能单体用量2 mmol、交联剂用量2 mmol，吸附载量（109.04±1.49）ng/g】提高了0.79倍。

2.4 CIT 分子印迹聚合物的吸附特性研究

以功能单体MAA 为对照，对比量子化学筛选的最优功能单体2，6-DAP 对桔霉素的吸附效果。从图5 可看出，无论是动态吸附还是静态吸附，用2，6-DAP 合成的MIP1 对桔霉素的吸附载量都要大于以MAA 合成的MIP2，说明量子化学方法对功能单体筛选具有实用性。对于MIP1，当吸附时间超过120 min 时，其吸附载量已趋近饱和，在150 min 时吸附载量最大，为（197.95±1.40）ng/g；由静态吸附曲线可知，当桔霉素含量低于400 ng/mL 时，MIP1 能够快速吸附桔霉素，当其质量浓度大于400 ng/mL 时，MIP1 对桔霉素的吸附已接近饱和，在桔霉素质量浓度为500 ng/mL 时，其最大吸附载量为（207.05±1.97）ng/g，其结果接近于动态吸附最大吸附载量，也接近于响应面优化结果，说明MIP1 的吸附性能较为稳定。

图5 各聚合物的动态吸附曲线（a）和静态吸附曲线（b）Fig.5 Dynamic adsorption curve（a）and static adsorption curve（b）of each polymer

MIP1 对功能红曲FHQ2 醇提液中桔霉素的吸附效果（图6）显示，桔霉素峰形良好无干扰，说明桔霉素和1H2NA 的同时检测方法也适用于桔霉素的分离检测。MIP1 对桔霉素的吸附能力均优于MIP2 和NIP1，其吸附后的溶液中桔霉素的峰面积较原液下降了82.98%，大于MIP2 的26.89%和NIP1 的7.72%；同时，MIP1 和MIP2 这两种印迹聚合物对桔霉素都有一定的识别吸附能力，因此在红曲醇提液中MIP1 和MIP2 对桔霉素吸附量的比值（3.09 倍）与桔霉素标品溶液中MIP1 和MIP2 对桔霉素吸附量的比值（3.03 倍）基本一致。

图6 各聚合物对功能红曲醇提液中桔霉素的吸附效果Fig.6 Adsorption effect of polymers on CIT in alcohol extract of functional Hongqu

3 讨论

计算机分子模拟技术是量子化学理论的进一步升华，将其应用于分子印迹技术能够预测不同分子之间的结合位点及结合能力[23]，从而在筛选合成原料[24]、确定不同合成原料之间比例[25]、选择合适致孔剂[26]等方面发挥作用，还能为印迹聚合物对目标物的识别机理提供理论解释[27]，有利于节约试验物资成本和时间成本。然而，使用不同程序进行计算有可能得出不同的结果，量子化学计算结果只能提供理论参考，最终优化结果还需要通过试验进行验证。

虽然本研究所合成的MIP1 对CIT 具有良好的吸附特性，但从静态吸附特性曲线中可知，在吸附体系中，当1 g MIP1 添加60 μg CIT 时，MIP1对CIT 的吸附载量为207.05 ng/g，目标物与印迹聚合物的识别空穴结合能力较低，这也是分子印迹聚合物可能存在的缺陷[28-30]。为克服该缺陷，除了优选制备原料和制备工艺外，通常会将聚合物尽可能地研磨和过筛，以此在洗脱过程中脱除“包埋”过深的模板，尽量暴露出隐藏在聚合物内部的识别位点，减少目标物在被识别过程中的运动阻碍，以提高聚合物的吸附载量[31-32]。然而，研磨操作也可能会破坏所构建的具有识别能力的空间结构，增加了非目标物的竞争吸附。表面分子印迹技术能够在基质材料表面建立一层分子印迹聚合物[33]，该聚合物比表面积较大[34]，能够避免聚合物研磨带来的问题，然而目前表面分子印迹技术尚处于发展阶段，这种聚合物本身对目标物的结合容量小，仅能对目标物进行分析检测，对其富集能力略显不足[35]。就当前技术而言，开发检测和富集兼备的分子印迹技术仍有很大的发展空间。

4 结论

基于HPLC 的CIT 和1H2NA 的同时检测方法能够满足对印迹聚合物构建过程中样品的分析检测，也适用于功能红曲中CIT 的分离检测。响应面优化MIP1 的制备工艺能使最优配方下的MIP1对CIT 吸附载量提高0.79 倍。基于量子化学方法优选出的功能单体2，6-DAP 所构建的MIP1 相比于常用功能单体MAA 所构建的MIP2 对CIT 吸附能力更佳，其吸附载量是后者的3 倍。