2021年桂林市食源性沙门菌的同源性及耐药特征分析

王春旭，王彦文，黄辉，邓洁妤，贺漓漓，朱相丞

桂林市疾病预防控制中心检验科，广西桂林 541001

沙门菌是一种自然界中最常见的人畜共患的病原微生物，属肠杆菌科，在动物体内可呈现显性或隐性感染，而当人食用感染和（或）污染的动物源性食品时，可引起人食物中毒，导致大量感染和死亡病例，对人类健康和社会经济造成重大负担[1-3]。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）的调查结果，沙门菌感染占细菌性食物中毒的42.6%～60.0%，被列入重度和中度风险食源性病原体名单，且沙门菌也被认为是导致食物中毒的第二大病因[4]。据估计，全世界每年由非伤寒沙门菌引起的病例达9380 万例，并造成15.5 万例死亡，其中食源性沙门菌所致病例约占86.0%[5]。在我国，每年因感染沙门菌而患病者约达上亿例，占所有食源性疾病致病菌首位[6-8]。在桂林市，历年的食源性风险监测结果显示，沙门菌检出率最高[9-10]。

沙门菌作为重要的食源性病原菌，给人和动物的生命健康均带来较大威胁。人和动物在治疗沙门菌疾病时，抗生素的不规则使用导致沙门菌耐药问题不断出现[11]。近年来，细菌耐药性（antimicrobial resistance，AMR）成为一个高关注度的全球性问题[12]。众多研究显示，沙门菌的耐药状况较为严重，且存在多重耐药，对食源性疾病的防控与治疗带来更多的困难[13]。因此，很有必要了解沙门菌的感染状况、来源及其耐药情况，为更有效地防控食源性沙门菌的感染及危害提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2021年分离自猪肉、草鱼鱼生、烧鸭等食品样品的104 株沙门菌，连同食源性疾病主动监测哨点医院提供的分离于自述摄取食品后腹泻患者的粪便/肛拭子中的12 株沙门菌，共计116 株沙门菌。

1.2 试剂

沙门菌显色培养基（法国科玛嘉CHROMagar公司）；XLT4 培养基（广东环凯微生物科技有限公司）；诱导培养基（法国科玛嘉CHROMagar 公司）；沙门菌诊断血清（丹麦SSI 公司）；革兰阴性致病菌药敏检测板（赛默飞公司）；蛋白酶K（德国Merck公司）；Seakem Gold 琼脂糖（美国Cambrex 公司）；gelred 染液（美国Biotium 公司）；XbaI 限制性内切酶（New England 公司）。

1.3 仪器

全自动生物质谱检测系统（法国布鲁克公司）；ATB Expression 全自动细菌鉴定仪（法国生物梅里埃公司）；全自动微生物鉴定和药敏分析仪（美国THERMO 公司）；CHEF Mapper XA 脉冲场电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；Gel Doc XR＋全自动凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）。

1.4 方法

将分离到的沙门菌菌株使用丹麦沙门菌诊断血清进行玻片凝集试验，并依据White-Kauffmann-LeMinor抗原表判定其血清型；用革兰阴性致病菌药敏检测板和全自动微生物鉴定和药敏分析仪进行15 种抗生素的药物敏感性实验，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，参照2020年美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）标准及试剂说明书，抗菌药物敏感性分为敏感、中介、耐药；参照国家食源性疾病溯源网络（TraNet China）操作手册，进行CHEF-mapper 脉冲场凝胶电泳（以沙门菌标准株H9812 为分子量标记），电泳结束后，GelRed 染色，凝胶成像系统拍摄图像，将图谱导入Bionumerics 6.6 软件进行聚类分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计学软件对数据进行处理分析，计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，采用四格表或R×C 表χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 沙门菌检出情况

在422 份样本中，有74 份样品检出沙门菌，总检出率 17.54%；市售肉制品的沙门菌检出率为51.67%（62/120）高于腹泻患者的沙门菌检出率[3.97%（12/302）]，差异有统计学意义（P<0.01）；在市售肉制品中，以生猪肉的沙门菌检出率最高，为75.00%（60/80），其次为即食生鲜水产品[5%（1/20）]和熟肉制品[5%（1/20）]，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。

表1 不同生物样品沙门菌检出结果

2.2 沙门菌的同源性分析

2.2.1 检出的沙门菌菌株情况 在所检测的样本中共检出沙门菌116 株，经鉴定分属17 个血清型；血清型分布广泛，主要为里森沙门菌，占菌株总数的33.62%（39/116），其次是鼠伤寒沙门菌，占25.86%（30/116）。

在所检出的116 株沙门菌中，12 株源自腹泻患者，104 株源自市售肉制品，其中102 株源自生猪肉、1 株源自摄食的生鲜水产品、1 株源自熟肉制品，见表2。

表2 沙门菌血清型分布[n（%）]

2.2.2 沙门菌菌株同源性分析 ①鼠伤寒沙门菌同源性分析：在检出的30 株鼠伤寒沙门菌中，选取14株（其中5 株来源于生猪肉，9 株来源于腹泻患者）进行脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE），共获得14 个指纹图谱，分为12 个不同图谱类型，其中指纹图谱相似度为100%的菌株有3 株，均来自生猪肉碎。主要形成2 簇，1 簇的聚类相似度为82.8%～100.0%，来自生猪肉和腹泻患者，另1簇的聚类相似度为87.0%～96.6%，来自腹泻患者，表现较高的亲缘性，聚类分析结果见图1。②里森沙门菌同源性分析：在检出的39 株里森沙门菌中，选取8 株（全部来源于生猪肉）进行PFGE，共获得8个指纹图谱，分为6 个不同图谱类型，其中指纹图谱相似度为100%的菌株有2 株；聚类相似度为88.3%～100.0%，表现为较近的亲缘关系。聚类分析结果见图2。③伦敦沙门菌同源性分析：在20 株伦敦沙门菌中，选取6 株（其中5 株来源于生猪肉、1株来源于腹泻患者）进行PFGE，共获得6 个指纹图谱，分为6 个不同图谱类型，指纹图谱均不相同；聚类相似度为68.5%～96.3%，聚类分析结果见图3。

图1 鼠伤寒沙门菌PFGE 聚类分析图

图2 里森沙门菌PFGE 聚类分析图

图3 伦敦沙门菌PFGE 聚类分析图

2.3 沙门菌的耐药特征分析

检出的116 株沙门菌对四环素的耐药率最高，达80.17%，其次是氨苄西林（70.69%）和氯霉素（65.52%）。来自食品和腹泻患者的菌株除对头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑林的耐药性差异有统计学意义（P<0.05）外，对其余抗生素的耐药性差异均无统计学意义（P>0.05），见表3。

根据肠杆菌科药敏试剂板说明书的结果判定标准，116 株沙门菌对四环素、氨苄西林和氯霉素的耐药率差异有统计学意义（P<0.05），最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）值大于最高限值32μg/ml的占比差异无统计学意义（P>0.05），见表4。

表4 不同来源的沙门菌对四环素、氨苄西林和氯霉素的耐药情况（%）

3 讨论

沙门菌是较为常见的肠道致病菌，健康动物携带该菌后通过各种途径由食物链传递给人类。沙门菌所导致的食源性疾病暴发与食用畜禽产品具有较高的关联性，可引发肠胃炎、败血症等疾病，对人类健康和社会经济造成较大影响。本研究对桂林市2021年市售肉制品与食源性腹泻患者样本检测的沙门菌总检出率为17.54%；分类分析结果显示，来源于腹泻患者的沙门菌检出率为3.97%，低于十堰市、上海市青浦区等地的沙门菌检出率[13-14]；高于云南省和江苏省等报道的沙门菌检出率[15-16]。源自市售肉制品的沙门菌检出率为51.67%，其中生猪肉的沙门菌检出率最高（75.00%），表明2021年桂林市无论是熟肉制品还是生猪肉其沙门菌检出率均居较高水平，高于深圳市福田区、宜春市、上海市浦东新区和广西的市售肉制品沙门菌检出率[17-20]。

人类沙门菌的感染主要取决于其身体状况与沙门菌的血清型，而广泛分布于自然界的沙门菌血清型众多。在我国积极监测的散发性沙门菌感染中，鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌是最常见的血清型[21]；本研究检测桂林市2021年与人类食源性中毒相关的沙门菌常见血清型，共检出沙门菌116 株，分属17个血清型，优势血清型为里森沙门菌，其次是鼠伤寒沙门菌。从不同样本来源角度分析，市售肉制品与腹泻患者的优势沙门菌血清型具有较大差异，其中腹泻患者主要以鼠伤寒沙门菌为主，其次为伦敦沙门菌；来自腹泻患者的结果与其他地区基本一致[16,22-24]；而源自市售肉制品中的生猪肉则主要以里森沙门菌为主，其次是鼠伤寒沙门菌，与河北省廊坊市的报道结果相似，但与广西的既往调查结果有差异[20,25-26]。在生猪肉分离出的102 株沙门菌中，32 份生猪肉样品同时检出2～4 种不同血清型沙门菌，最多的混合4 种血清型。结果提示桂林市生猪的沙门菌携带率处于较高水平或生猪宰杀、销售场所的沙门菌污染情况较严重，需要对生猪包括饲养、宰杀、销售等所有环节的沙门菌污染情况及生猪肉的沙门菌携带情况加大防控力度，以保障广大人民群众的身体健康。

PFGE 被视为细菌基因分型方法的“金标准”，该技术是通过限制性内切酶切割细菌DNA，凝胶电泳成像后，在酶切图谱上展现基因的序列差异，由软件聚类分析和比对后，确定菌株间的亲缘关系，实现细菌溯源和进化分析[27-28]。本研究对2021年检出的鼠伤寒沙门菌、里森沙门菌、伦敦沙门菌进行聚类分析，结果提示桂林市售猪肉和腹泻患者的鼠伤寒沙门菌和里森沙门菌具有较高的亲缘性，很可能为同一传染源；腹泻患者体内的鼠伤寒沙门菌很可能源自猪肉通过染色体水平转移方式传递，因此，加大市售肉制品特别是生猪肉的病原体防控可有效降低食源性沙门菌食物中毒的发生。

防治沙门菌感染主要依赖抗生素的使用，但细菌耐药性日益升高，食源性沙门菌感染的治疗与控制存在一定难度。本研究的药敏结果显示，116 株沙门菌对四环素的耐药率最高，其次是氨苄西林，与武汉地区、十堰市报道的结果相似[13,29]。本研究结果提示，桂林市食源性沙门菌耐药现象严重，且呈现多重耐药，归因于两方面：①细菌和其他病原体不断进化，可抵抗大部分临床医学所用抗生素药物；②发现新抗菌药物的速度大幅放缓，而人和动物的抗生素使用率在不断上升[12]；同时促成耐药基因的传播，且这些耐药菌株还可通过食物链传播，从而威胁公共安全，严重影响人类健康[30]。

综上，桂林市食源性沙门菌检出率较高，患者以鼠伤寒沙门菌为优势血清型，而市售肉制品特别是生猪肉以里森沙门菌为优势血清型。无论来自患者还是来自市售肉制品的沙门菌耐药率均较高，且具有多重耐药性；四环素、氨苄西林和氯霉素是其主要耐受抗生素。市售肉制品特别是生猪肉和腹泻患者的沙门菌有交叉感染现象，应加大力度控制肉制品特别是生猪肉的沙门菌感染，同时根据本地区沙门菌的耐药特征，制定有针对性的诊疗方案和预防控制措施。