BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56四种抗体联合检测在甲状腺乳头状癌诊断中的应用价值

姚丽倩 顾婷婷

江苏大学附属昆山医院 昆山市第一人民医院病理科，江苏昆山 215300

甲状腺癌是常见的内分泌器官恶性肿瘤，其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见类型[1]。虽然大部分PTC恶性度低，预后良好，但是仍有10%的患者发生侵袭及远处转移，且发病人群年轻化[2]。目前临床上超声引导下细针穿刺活检细胞学是诊断PTC的有效方法，但因超声穿刺取样、人工制片及病理医生阅片等多方面的原因，只有70%～80%的患者得以确诊[3]。研究表明，特异性分子标志物可提高甲状腺良、恶性结节的诊断准确度。近年来，已有研究建议将鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF）、细胞角蛋白19（cytokeratin19，CK19）、人骨髓内皮细胞标志物（human bone marrow endothelial markers，HBME-1）和神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule 56，CD56）等分子标志物用于临床诊断PTC，但这些标志物的可靠性还存在较大的争议[4]。本文旨在探究BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56四种抗体单独和联合检测诊断PTC的效果，确定其在临床诊断PTC的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年11月至2022年11月昆山市第一人民医院（本院）病理科179例甲状腺手术标本，其中62例结节性甲状腺肿、腺瘤等结节为良性组，117例PTC结节为恶性组。良性组男10例，女52例；年龄25～78岁，平均（52.9±13.48）岁；平均病程（16.85±6.21）个月。恶性组男36例，女71例；年龄26～76岁，平均（43.45±11.71）岁；病程（12.95±4.25）个月；肿块直径0.1～3.8 cm，平均（0.92±0.35）cm。纳入标准：无其他肿瘤病史、免疫系统及感染性疾病史；无手术史及放化疗史。排除标准：免疫组织化学检测指标不完整；术前合并髓样癌、滤泡癌等其他类型肿瘤。本研究经本院医学伦理委员会审核批准（伦理审批号：2021-06-040-K01）。

1.2 免疫组织化学方法

常规石蜡制片，厚度3～4 μm切片备用。EnVision法染色，DAB显色，苏木精复染。一抗BRAFV600E抗体（克隆号VE1）购自Roche公司，CK19、HBME-1、CD56单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，严格按照说明书操作。

1.3 结果判读

显微镜观察切片染色情况，无着色0分、黄色1分、棕色2分、褐色3分。阳性细胞数＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。着色强度与阳性细胞数百分比两项所得分数相乘，0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～6分为阳性（++），＞6分为强阳性（+++）[5]。结果由两名高年资医师判读。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTC病理巨检及苏木精-伊红染色特点

PTC结节肉眼观察多为灰白、实性、质中，与周围甲状腺组织界限欠清。组织学上PTC细胞呈乳头状结构及腺管样结构，细胞核偏大，呈毛玻璃状，可见核重叠、核沟及核内包涵体。

2.2 BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56抗体在甲状腺良、恶性结节的表达

对179例甲状腺结节行免疫组化染色，BRAFV600E表达定位于PTC细胞胞质，多呈中-强阳性（图1A）；CK19表达定位于PTC细胞胞质，多呈弥漫强阳性（图1B）；HBME-1表达定位于PTC细胞胞质及胞膜，呈中-强阳性（图1C）；CD56表达定位于甲状腺滤泡上皮细胞胞膜，呈强阳性，PTC细胞为阴性（CD56在PTC细胞膜染色阴性作为诊断PTC的阳性判断）（图1D）。

图1 PTC细胞BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56抗体免疫组化染色

BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56在PTC结节和良性结节中表达率比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。本组117例PTC中，BRAFV600E阳性100例（85.47%），CK19阳性117例（100.00%），HBME-1阳性116例（99.15%），CD56阴性109例（93.16%）；62例良性结节中，BRAFV600E阳性3例（4.84%），CK19阳性26例（41.94%），HBME-1阳性5例（8.06%），CD56阴性6例（9.68%）。见表1。

表1 BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56在甲状腺良、恶性结节表达率比较

2.3 BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56在甲状腺良、恶性结节的诊断效能

BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56联合诊断PTC时，联合诊断的灵敏度、特异度和准确性均高于各项指标单独诊断的灵敏度、特异度及准确性，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。灵敏度=真阳性例数/（真阳性+假阴性）例数×100%；特异度=真阴性例数/（真阴性+假阳性）例数×100%；准确性=（真阳性+真阴性）/总例数×100%。见表2。

表2 BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56诊断PTC的效能（%）

3 讨论

甲状腺结节可发生于各个年龄段，女性居多，患者多无明显症状，少数会出现咽喉疼痛不适感[2]。PTC多分化较好，易与良性增生病变混淆。其次甲状腺炎症时，间质纤维组织增生，又易导致临床发生误判。免疫组化是目前临床病理普及的方法，当多种抗体优化组合能更有效地鉴别甲状腺良、恶性结节。

BRAF在丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK）信号通路中，通过激活P21从而修复基因损伤，是一种抑癌基因。甲状腺中，该基因突变导致编码蛋白异常，使其失去抑癌作用，进而引起细胞发生异型增生，导致癌变[6]。目前与BRAF基因突变相关研究多建立在基因水平上，而禹乐等[7]研究表明，运用免疫组化方法检测BRAFV600E表达产物（单克隆抗体VE1）与BRAFV600E基因突变有高度一致性。本研究中，良性组BRAFV600E抗体阳性率为4.84%，且染色均为轻-中等强度；恶性组BRAFV600E阳性表达率85.47%，明显高于良性组，且染色均为中-强阳性。BRAFV600E诊断PTC特异性达95.16%，灵敏性85.47%，准确性88.83%，是诊断PTC的可靠标志物。CK19是一类低分子量角蛋白，通常表达于胆管、胰腺等上皮细胞[8]。近年来研究发现，CK19在PTC中表达水平较高，多表现为中等及以上强度表达，灵敏度高达100%。但是，CK19特异度不高，在甲状腺良性病变也可呈阳性表达，只是表达强度及阳性率不稳定[9]。结果显示，CK19在PTC结节的灵敏度也为100%，但其特异度仅58.06%，诊断准确性为85.47%。值得注意的是，CK19在良性结节中的阳性率虽达到了41.93%，但其染色均为中等及以下强度，而在PTC结节中，均为弥漫强阳性，说明CK19中等以上强度着色对PTC有较好的警惕性作用，但其低特异性导致其在临床应用受限[10]。HBME-1是一种特异性抗原成分，存在于间皮细胞表面微绒毛，常在间皮瘤和一些腺癌细胞中表达，在肿瘤中起促进血管形成及细胞增殖作用，进而促进肿瘤进展[11]。相关研究报道，HBME-1在PTC组织中特异度和灵敏度均较高，且多呈中度或强阳性表达，而在结节性甲状腺肿等良性病变中很少表达，其在PTC结节和甲状腺良性结节的表达率比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05）[12]。本研究结果中，HBME-1在甲状腺癌组织中阳性表达率为99.15%，在甲状腺良性结节中的阳性表达率为8.06%，诊断PTC的特异性为91.93%，准确性高达96.65%。可见，HBME-1在用于PTC的诊断与鉴别诊断时，是比较理想的标志物。临床诊断中，可选择特异度高的HBME-1和灵敏度强的CK19蛋白联合诊断PTC，大大提高其诊断准确性。CD56在NK细胞、星形细胞、施万细胞、神经元及少量活化的T细胞中表达，是神经细胞黏附、神经外胚层及神经内分泌组织细胞的介导因子，CD56表达缺失或降低可促进肿瘤的增殖和迁移，还与患者预后相关[13]。研究显示，CD56蛋白在PTC中表达缺失，在甲状腺正常滤泡上皮细胞及良性病变中呈阳性表达[14]。本研究结果表明，恶性组CD56阴性表达率为93.16%明显高于良性组的9.68%，CD56灵敏度、特异度和准确性均高达90%以上。郭宏义等[15]研究表明，合理地联合应用分子标志物能显著提高临床诊断PTC的准确性。这一结果与本研究结果相吻合，具有可信度。同时提示在甲状腺良、恶性结节鉴别诊断中，从抗体的表达水平，抗体的染色强度等多个角度综合判定，可大大提高PTC的诊断准确性。本研究中BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56联合抗体诊断PTC的灵敏度、特异度和准确性均达到100.00%，诊断效能均高于各个抗体单独使用，说明抗体合理地联合使用是诊断PTC的极可靠的辅助工具。

综上所述，BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56是甲状腺良、恶性病变鉴别诊断的重要辅助指标，CK19阳性表达是诊断PTC的敏感性指标，BRAFV600E、HBME-1异常过表达和CD56表达缺失是诊断PTC的特异性分子标记，合理运用这四种标志物组合，联合检测有助于临床提高PTC的诊断准确性。同时，运用免疫组化方法检测BRAFV600E突变较基因测序成本低、效率高，具有一定的社会效益，值得推广。