木瓜蛋白酶制备北极甜虾虾壳多肽工艺研究*

刘雪凌，林 贝，周莉莉，于 翠，亢 娜

(燕京理工学院，河北 三河 065201)

虾壳含有丰富的蛋白质、甲壳质和酶等，可提取制备活性多肽，作为化妆品中的化工原料或者医药材料[1-3]；京津冀地区以及其它沿海城市有很多水产公司以及餐饮店，以及在唐山、秦皇岛等沿海城市进入旅游旺季时人们大量食用海鲜，产生很多虾头、虾壳固体废物。如果回收利用虾头虾壳制造高附加值的化工产品活性肽，不仅可以消除环境污染，还可以增加公司的经济效益，并且可以安排城镇职工就业。

目前，国内外制备多肽的方法主要有：蛋白酶水解法、化学合成法、基因重组法、分离提取法等。蛋白酶水解法应用较为普遍。化学合成法包括固相合成法和液相合成法。固相合成法多应用于实验室利用基因工程的方法开发各类蛋白多肽类药物已应用于医疗实践中。随着现代生物技术的发展，用于蛋白质及多肽分离纯化的方法日益先进。

1 实 验

1.1 材料与试剂

北极甜虾虾壳，山东荣信水产食品集团股份有限公司提供；木瓜蛋白酶(800 μg/mg，生化试剂)，山东卡贝因生物科技有限公司；无水乙醇(分析纯)，山东德彦化工有限公司；磷酸氢二钠(分析纯)，廊坊市金海化工有限公司；盐酸(分析纯)，济南竞宇新材料技术有限公司；考马斯亮蓝G-250，沈阳晟达化工有限公司；磷酸(85%，分析纯)，济宁市旭力化工有限公司；牛血清蛋白(生化试剂)，西安泽邦生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FA1004B电子分析天平，上海佑科仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥机，沧州晶硕试验仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；组织捣碎机，常州市万丰仪器制造有限公司；乳化机，安徽博进化工机械有限公司；旋转蒸发仪，上海岐耀仪器设备有限公司；紫外分光光度计，杭州俊升科学器材有限公司。

1.3 实验方法

将北极甜虾虾壳放入干燥箱中低温(约50 ℃左右)干燥，放进组织粉碎机中粉碎成粉末，然后装入自封袋中备用；实验时取适量虾壳粉，用无水乙醇脱色，过滤后留取滤渣，滤渣用去离子水洗涤2～3次后，加入木瓜蛋白酶溶液进行酶解制取多肽，同时用磷酸氢二钠缓冲溶液和盐酸调节pH，提取制备一段时间后放进旋转蒸发仪进行离心分离，取上清液放进烘箱进行烘干，烘干后进行称量并计算多肽产率[4]，同时对产品测定水解度测定[5]。

该制备工艺研究了酶解浓度、酶解温度、酶解时间、酶解pH对多肽产率的影响，同时通过正交实验进行了最佳工艺研究。

式中：m1——干燥后烧杯和产物的总质量，g

m2——空烧杯的质量，g

M——称取原料粉末的质量，g

酶解液中氨基酸态氮通过甲醛滴定法滴定，水解度的计算公式如下：

水解度=(酶解液游离氨态氮含量-酶解前游离氨态氮含量)/原料总氮含量×100%

1.4 统计分析

采用spss软件(spss19.0)对所得数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 影响北极甜虾虾壳多肽产率的因素[6-7]

2.1.1 不同酶解时间对木瓜蛋白酶提取多肽的影响

在5 g北极甜虾虾壳粉中放入体积为50 mL酶浓度为1.00%的木瓜蛋白酶，用磷酸二氢钠调节pH=7.0，置于55 ℃水浴条件下分别反应0 min、20 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min。其结果见图1。从图1中可以看出：当反应时间从0 min到180 min时，多肽产率和水解度先上升后下降，后又稍稍上升，在40 min时达到最高。此变化规律原因可能是反应时间过长会产生很多除多肽以外的其它杂质，杂质附着在底物四周从而降低酶反应效率。

图1 酶解时间对多肽产率和水解度的影响

2.1.2 不同酶浓度对多肽产率和水解度的影响

在5 g北极甜虾虾壳粉中，分别加入酶浓度(酶的质量(mg)/溶剂体积(mL))为0.12%、1.00%、2.50%、5.00%、7.50%、10.00%、12.5%、15.0%、17.5%的木瓜蛋白酶50 mL，用磷酸二氢钠调节pH=7.0，置于温度为55 ℃的水浴条件下提取120 min。其结果如图2所示。从图2可以看出：酶浓度从0.12%升高到17.5%时，多肽产率和水解度逐渐升高，后又降低，在酶浓度为10%时多肽产率和水解度最高。分析原因可能是多肽产率和水解度达到最高点后继续增加酶浓度导致酶饱和，酶解反应趋于缓慢，导致多肽产率下降；并且北极甜虾虾壳粉相对比较坚硬，水解度均偏低。

图2 不同酶浓度对多肽产率和水解度的影响

2.1.3 酶解pH对木瓜蛋白酶提取多肽的影响

在5 g北极甜虾虾壳粉中放入体积为50 mL酶浓度为1.00%的木瓜蛋白酶，用磷酸二氢钠分别调节pH=1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，置于60 ℃水浴条件下反应120 min。其结果见图3。从图3中可以看出：当反应pH从1.0上升到9.0时，多肽产率和水解度先上升后下降，后又稍稍上升。这样的变化规律原因可能是pH从1.0到3.0时，由于过酸导致酶变性失活，从7.0到9.0由于酸性减弱碱性增强，碱性过强导致酶变性失活，pH为4.0时达到最高值；木瓜蛋白酶最适pH范围是5.0～7.0，在综合反应条件下，会稍有变化，因此与实验数据基本符合。

图3 pH对多肽产率和水解度的影响

2.1.4 酶解温度对木瓜蛋白酶提取多肽的影响

在5 g北极甜虾虾壳粉中放入酶浓度为1.00%的木瓜蛋白酶50 mL，用磷酸二氢钠调节pH=7.0，分别置于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃的水浴条件下提取120 min。其结果如图4所示。从图4中可以看出：当温度从30 ℃升高到70 ℃时，多肽产率和水解度先上升后缓慢下降，在50 ℃时达到最高。分析原因可能是木瓜蛋白酶的有效温度范围为20～80 ℃，最适温度范围因反应条件而稍有变化，一般为50～60 ℃，温度高于60 ℃时，木瓜蛋白酶逐渐钝化，反应性能逐渐下降，但在较高温度下也增加一些物质的溶解度，从而多肽产率下降缓慢。

图4 酶解温度对多肽产率和水解度的影响

2.2 正交实验

在以上单因素实验的基础上，对A酶解时间(30 min、40 min、60 min)、B酶浓度(7.5%、10%、12.5%)、C 酶解pH(3、4、5)、D酶解温度(45 ℃、50 ℃、55 ℃)在4因素3水平上进行优选，进行L9(34)正交试验，见表1。

表1 正交实验结果

由表1可知，从极差R值看，B酶浓度>D酶解温度>A酶解时间>C酶解pH，所以交酶浓度对多肽产率的影响效果是最显著的。根据以上实验可知，最佳多肽的制备工艺为：A2B3C2D2，即酶解时间为40 min、酶浓度为12.5%、酶解pH为4、酶解温度为50 ℃。

3 结 论

采用木瓜蛋白酶酶解技术从北极甜虾虾壳粉中制备活性多肽，通过单因素和正交实验可以得到较好的实验结果。此研究可以助力水产类企业综合利用废物，生产高附加值的产品，具有重要的经济意义和社会意义。通过研究，可得到以下结论：

(1)经过单因素实验，酶解时间、酶浓度、酶解pH、酶解温度过低和过高都会影响虾壳多肽产率和水解度，随着单因素的变化，多肽产率和水解度会先升高再降低，其峰值为最佳的多肽制备条件。而从各单因素来看，多肽产率和水解度最高时酶解时间为40 min、酶浓度为10%、酶解pH为4、酶解温度为50 ℃。

(2)通过正交实验，可以得出各因素水平的最佳组合为A2B3C2D2，即酶解时间为40 min、酶浓度为12.5%、酶解pH为4、酶解温度为50 ℃。

(3)实验原材料北极甜虾虾壳粉比较坚硬，在木瓜蛋白酶溶液进行酶解制备多肽时，直接进行酶解可能效果会差一些，因此需要在原材料预处理方面进行研究探索。