链霉菌次级代谢产物化学成分研究*

朱梦月，侍慧慧

(南京医科大学康达学院药学部，江苏 连云港 222000)

天然产物是一类由动植物和微生物等生物体代谢所产生的具有多种生物活性的小分子化合物[1]，结构的复杂性和多样性使它们广泛成为药物和药物先导化合物[2]。随着科技发展和人们对天然产物的深入研究，越来越多的微生物天然产物被分离鉴定，并作为源头分子应用于新药研发[3-6]，数据表明过去的四五十年间，约 46% 具有治疗效果的小分子药物来源于未经修饰的天然产物或其衍生物[7]。

微生物次级代谢产物种类丰富，生物活性强。在已知结构的 160 000 种天然产物中，约 50% 来自微生物，其中约 25% 是具有生物活性的小分子，包括抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂、酶抑制剂和生物除草剂等，涉及人类生活的方方面面[8]。放线菌是自然界中分布广泛的一类重要微生物资源，而链霉菌是其中数量最为庞大的属。链霉菌次级代谢产物丰富多样、结构新颖、且具有较好的生物活性，是新型抗生素的重要来源。随着测序技术和生物信息学的发展，科学家意识到链霉菌中大量基因簇处于沉默状态这也就意味着链霉菌中仍有大量新型活性天然产物亟待发掘[9]。其中芳香族聚酮类化合物是一类具有抗病毒、抗真菌、细菌、抗肿瘤、抗寄生虫、酶抑制剂以及免疫抑制剂作用等多种生物活性，结构多样化的细菌次生代谢物，是宝贵的药源分子资源库[10-14]。在数代人不懈努力下，许多聚酮类化合物及其半合成衍生物已作为高效药物应用于临床，如四环素类抗生素及抗肿瘤药物光神霉素和阿霉素等[15-16]。

但是随着抗生素广泛使用甚至滥用，细菌耐药性逐年增加，耐药性细菌感染不仅严重危害人类健康，而且已成为世界范围的棘手问题，所以深入挖掘微生物来源新型天然产物仍是当今药学领域的研究重点[17]。

基于链霉菌的巨大资源优势，本文重点研究从连云港花果山上采集的土壤样品中分离出一株链霉菌编号NA07292，通过基因组测序鉴定为链霉菌属Streptomyces peucetius。根据NA07292次级代谢产物紫外图谱，推测出次级代谢结构上属于聚酮类[18-19]，这一类化合物具有多种生物活性、结构多样，有望从中分离出活性较好的药物先导分子。对这一株菌的次级代谢产物进行扩大培养，采用Sephadex LH-20 柱色谱、正相硅胶柱、反相硅胶柱、高效液相制备色谱、等手段对其次级代谢产物进行分离纯化，最终分离出1个化合物，根据质谱、一维和二维波谱数据、理化性质等鉴定结构为4-O-(β′-D-glucopyranuronosyl)-ε-rho-domycinone(1)(图1)，诸多同类吸收的化合物待分离，结构上都属于芳香聚酮类化合物。

图1 化合物1的化学结构

1 实 验

1.1 材料、仪器、试剂、培养基等

1.1.1 材料与工具

主要材料：TLC 硅胶板(5×20 cm)烟台江友硅胶开发有限公司；反相柱色谱(ODS 填料)，日本YMC有限公司；凝胶填料(Sephadex LH-20)，Pharmacia Biotech公司；柱色谱硅胶(200～300目)，青岛海洋化工；树脂等。

工具：200 μL和1 mL移液枪配备200 μL和1 mL 枪头；培养皿；EP管；镊子；剪刀；研钵；酒精灯；接种环；涂布环；分液漏斗；旋蒸瓶；1 L锥形瓶；青霉素小瓶等。

1.1.2 仪器

电子天平；生物安全柜；超净工作台；高压蒸汽灭菌锅；-80 ℃超低温冰箱；恒温培养箱；高速离心机；恒温摇床；超纯水仪；冷凝循环装置CA-1111；旋转蒸发仪EYELAN-1000；半制备色谱柱MPLC(Agilent Eclipse XDB-C18，5 μm，250 mm×9.4 mm)；高效液相色谱仪HPLC(Agilient 1260 Infinity XDB-C18column，5 μm，250 mm×9.4 mm)；核磁共振仪(Bruker Avance III 400/600，TMS 为内标)；紫外测定仪(Nanodrop2000)；傅里叶变换红外光谱仪(Nexus 870 FT-IR)；紫外分光光度计(detector L-7400 UV)。

1.1.3 试剂

乙腈等(分析纯)，广州金华大化学试剂公司；甲醇；乙腈等色谱级别溶剂(海市百灵威)；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氘代DMSO，上海市恩拿马生物科技有限公司；二氯甲烷；缬氨酸；亮氨酸；D-FDAA，西格玛奥德里奇有限公司。

1.1.4 培养基

PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)：土豆210 g去皮，切成小块，加入适量水，煮沸30 min后，用两层医用纱布过滤得滤液，加水定容至1 L，再称取 2 g 蔗糖和 10%也就是20 g琼脂，混匀溶解后分装于5个锥形瓶中，115 ℃条件下灭菌 30 min，冷却至 60 ℃以下，加氨苄青霉素和卡那霉素各150 mg，摇匀后倒入培养皿，冷却凝固后备用。

Malt(麦芽培养基)：麦芽20 g左右加600 mL水煮沸30 min，用两层医用纱布过滤得滤液，加1 g蛋白胨，20 g蔗糖，加水定容至1 L后摇匀。

GS(高氏培养基)：1 g硝酸钾、0.5 g 氯化钠、0.5 g 三水合磷酸氢二钾、0.01 g七水合硫酸亚铁、0.5 g 七水合硫酸镁、20 g可溶性淀粉、10 g琼脂粉、加入1 L水定容，调节PH至7.4～7.6。

ISP4培养基：2 g氯化铵，2 g七水合硫酸镁，1.365 g磷酸氢二钾，2 g碳酸钙，1 g氯化钠，0.1 mL微量元素，10 g可溶性淀粉，20 g琼脂粉，加1 L水定容后，溶解摇匀。

CPA(纤维素脯氨酸琼脂培养基)：0.5 g氯化钙，0.25 g硝酸钾，0.2 g磷酸氢二钾，1.0 g脯氨酸，2.0 g丙酮酸钠，2.5 g羧甲基纤维素钠，0.2 g七水合硫酸镁，10 mg七水合硫酸亚铁，20 g琼脂粉，加1 L水溶解定容(CMC-Na提前用热水不断搅拌溶解，再加入重铬酸钾，保证终浓度为50 μg/mL)。

38#培养基：4.0 g葡萄糖，5.0 g麦芽浸出物，4.0 g酵母浸出物，1 mL复合维生素，20 g琼脂粉，用1 L水定容溶解。

TSB培养基：30 mg TSB用1 L水溶解。

F培养基：0.1 g酪蛋白水解物，10.0 g葡萄糖，20.0 g蔗糖，1.0 g六水合氯化镁，0.25 g硫酸钾，5.0 g酵母浸出物，5 g MOPs，0.1 mL微量元素，用1 L水溶解定容。

Y培养基：10.0 g麦芽浸出物，4.0 g葡萄糖，4.0 g酵母浸出物，用1 L水溶解。

A培养基：1 g碳酸钙，4 g酵母浸出物，2.0 g蛋白胨，0.04 g硫酸铁，0.1 g溴化钾，10.0 g可溶性淀粉，用1 L水溶解。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种分离方法及菌种鉴定

菌种分离方法：菌种编号NA07292这一株链霉菌是从江苏连云港花果山上的土壤样品中分离得到，用多种微生物培养基纯化，最后发现此菌只在ISP4培养基平板上生长。具体步骤：将土壤样品风干后各称取5 g左右，加入250 mL无菌水恒温悬浮2 h，再使用无菌水将其稀释成三个浓度梯度10-1、10-2、10-3，将三个浓度梯度分别用涂布棒涂布于PDA、GS、CPA、纯琼脂平板上，随后恒温培养直至长出单菌落后，再用Malt、ISP4、38#培养基纯化，最后发现只有ISP4培养基上菌落，其他培养基均无菌落，菌落特征是内生菌丝深紫色，气生菌丝白色。

菌种鉴定：将菌种孢子粉末沾取少量至EP管中，加入裂解液、Tris-HCl缓冲液(pH= 8.0)、 EDTA、NaCl和二烷基硫酸钠，置于涡旋混合仪混合，放入60 ℃水浴锅中孵育20 min，上下颠倒充分混匀。之后向混悬液中加入醋酸钾溶液，混匀后，离心10 min，吸取500 μL 上清至新EP管中，再加入同体积异丙醇，EP管上下颠倒至出现白色絮状沉淀，离心5 min，撇去上清液，再在EP管中加70%乙醇，混匀后离心3 min，再撇去上清，循环操作两次将带有基因组的EP管打开于室温下晾10 min后加65 ℃热水，基因组溶解后用NanoDrop2000 测浓度，并将提取的基因组片段送至擎科生物公司测序鉴定菌种。通过形态学和18S rRNA 序列对比，菌株鉴定结果表明属于该海洋放线菌NA07292是Streptomyces peucetius。

1.2.2 菌种的发酵及提取分离方法

将链霉菌NA07292(Streptomyces peucetius)纯化到ISP4平板培养基上培养一周，长出菌落后，配制1.0 L TSB培养液平均分装到5个1 L锥形瓶中，挑一块长有孢子的ISP4培养基接种到锥形瓶中，恒温28 ℃、140 rpm/min摇至瓶中长出密集菌粒，即可作为种子液。

配制Y培养基9 L，平均分装于35个1 L的锥形瓶中，115 ℃灭菌30 min，接种培养液量的5%即12.5 mL种子液，30 ℃恒温、220 rpm摇床发酵7天。

发酵完成后，用纱布过滤，纱布下方滤液即得菌液。往菌液中加入大孔树脂，吸附4 h，再用纱布过滤得到吸附后的树脂，树脂风干后用CH3OH浸泡3次，合并3次CH3OH浸泡液进行旋蒸浓缩后得到粗膏，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按1：1的比例各萃取3遍粗膏，旋蒸浓缩后可得3段粗浸膏，通过HPLC分析发现乙酸乙酯段粗浸膏有目标化合物。乙酸乙酯段粗浸膏共8.7 g。

8.7 g乙酸乙酯段粗浸膏首先用中压制备色谱MPLC分离，流动相组成为水和甲醇，按80%～20%甲醇梯度洗脱后，将多段洗脱液进行薄层色谱TLC分析，将有类似组分的洗脱液合并浓缩后，分为8组(Fr1-Fr8)。对Fr4和Fr6进一步分析纯化，Fr4段首先用凝胶柱色谱Sephadex LH-20 初步分离后，再用高效液相色谱HPLC纯化得到化合物1，剩余浸膏段待分离。具体分离流程如图2所示。

2 化合物的结构鉴定

化合物1：紫红色无定形粉末，高分辨质谱HRESIMS显示 m/z：627.378 5[M+Na]+，合理分子式C28H28O15，不饱和度为15，核磁数据见表1。

表1 化合物1的1H NMR (400 MHz)和13C NMR (100 MHz)数据归属 (DMSO-d6)

1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)谱中，低场区也就是芳香区出现一个苯环上3个相邻氢的特征信号 (δC/H120.95/7.97，δC/H136.4/7.90，δC/H122.91/7.73，)，中高场区出现糖环的5个氢的特征信号 (δH3.38，3.49，3.52，4.03，5.32)，高场区还出现2个亚甲基 (δH1.98～2.09，1.41～1.61)、2个甲基 (δH1.03，3.49 )、2个次甲基 (δH4.15，5.12)特征信号 ；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)谱中出现4个羰基碳特征信号 (δC186.8，186.87，171.24，170.64)，12个苯环区碳特征信号 (δC110～158)，糖环碳特征信号 (δC100.32，71.52～76.35)；分析谱图发现H-2 (δH7.90)与C-12 (δC186.87)存在HMBC相关、H-3 (δH7.73)与C-5 (δC186.8)存在远程HMBC相关，推测苯环连接对苯醌环，此时还剩6个苯环碳信号未归属，推测此化合物的基本骨架是蒽醌，同时也发现 H-10 (δH4.15)与C-13，C-6a，C-10a(δC171.24，135.12，139.22 )有HMBC相关，说明H-10与羰基和苯环有直接相连，H-7 (δH5.12)与C-10a，C-6a(δC139.22，135.12)存在HMBC相关，说明H-7与苯环也有直接相连；H-8 (δH1.98-2.09)与H-7存在COSY相关，H-8与C-9 (δC71.52)、 C-10(δC51.69)存在HMBC相关H-15 (δH1.41～1.67)与 C-10、C-9有HMBC相关，故H-9到H-7形成环系；根据COSY相关表明C-9连接一个CH3CH2，C-9有被羟基取代的碳位移特征信号；糖环中C-1′的δC100.832符合连氧的特征，又因为H-1′与苯环C-4相关，所以糖环应连在C-4，基于其它谱图信息，这一结构推测得到确认，查阅文献确认化合物1是已知化合物 4-O- (β′-D-glucopyranuronosyl)-ε-rho-domycinone(图3)[20]。

图3 化合物1的结构和二维核磁相关

3 结 论

本文研究链霉菌Streptomyces peucetius NA07292的次级代谢产物，通过发酵、分离和纯化得到聚酮类化合物1，还有众多聚酮类化合物待分离。化合物1是一类具有多环酚醛骨架的芳香族聚酮类化合物，这一类化合物被证明具有多种生物活性[21]，目前相关结构尚未有报道研究过相关活性，因此值得深入研究。