一种用于检测咖啡酸的荧光探针*

2023-12-14谢丽君苏爱玲陈佳琳黄丽欣刘炉英刘青青

广州化工 2023年14期

谢丽君，苏爱玲，陈佳琳，黄丽欣，刘炉英，刘青青

(广东第二师范学院化学系，广东广州 510303)

碳量子点(CDs)是一类尺寸小于10 nm的新型发光纳米粒子，其主要由碳、氮、氧三种元素组成。碳量子点具有生物相容性、化学稳定性、毒性低等特性。因此，碳量子点被广泛应用在光催化[1-2]、能源器件[3]、细胞成像[4]等领域。

咖啡酸是一种羟基肉桂酸的有机化合物，其能抗菌抗病毒和调节免疫等。因此，咖啡酸在临床治疗上发挥不可或缺的作用。但也有相关报道表明，过量的咖啡酸积累在人体内会有一定的致癌风险[5]。在2017年，咖啡酸还被列为二类致癌物。因此，合理控制咖啡酸的摄入量和监测人体内咖啡酸含量是非常有意义的。但现存的一些方法或多或少存在着需要进行一定的预处理、分析成本较高、检测时间过长等缺点，故需要开发一种新型的经济有效且简便快捷的测试方法。本文选用无水柠檬酸和N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷利用裂解法合成碳量子点(CDs)。基于咖啡酸能使该碳量子点发生荧光猝灭的原理，设计和开发一种基于碳量子点的荧光探针用于定量检测咖啡酸。

1 实验

1.1 试剂与仪器

无水柠檬酸和N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)，阿拉丁试剂公司；咖啡酸(AR)，麦克林生化科技有限公司；咖啡酸片，德州徳药有限公司。其它试剂均为分析纯试剂。实验用水均来来自超纯水机纯化的超纯水(18.2 MΩ·cm)，上海乐枫生物科技有限公司。

F97Pro荧光分光光度计，上海棱光技术有限公司；FEI talosf200s透射电镜，赛默飞世尔科技有限公司；Tensor27傅立叶变换红外光谱仪，德国布鲁克公司；稳态/瞬态荧光光谱仪FLS1000，美国爱丁堡；滨松量子效率测试系统，日本滨松光子学株式会社。

1.2 碳量子点的合成

在氮气氛围下，将10 mL的N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)放入100 mL三颈烧瓶中并开始升温。当三颈烧瓶内溶液达到240 ℃时，在剧烈搅拌的情况下将0.5 g的无水柠檬酸快速加入到三颈烧瓶中并保持1 min。最后，用石油醚充分洗涤3次得到最终产物，即可获得碳量子点[6]。将制得的有机硅烷化碳量子点用超纯水在棕色的容量瓶中配制成1 mg/mL的碳量子点储备液并将其放在4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 咖啡酸的测定

取2 mL的碳量子点储备液和2 mL的不同浓度的咖啡酸溶液，混合均匀并反应5 min。然后，测定混合溶液在激发波长为380 nm，激发和发射狭缝均为10 nm，增益为600 V时的荧光值并计算F0/F-1的值，其中F0为不存在咖啡酸时的荧光强度，F为存在咖啡酸时的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 碳量子点的表征

通过TEM、FTIR、UV-vis光谱和荧光光谱对CDs的显著特征进行分析和讨论。如图1a所示，CDs的透射电镜图显示合成的CDs呈现球形，平均粒径约为1.5nm，尺寸较为均一。如图1b所示，CDs红外谱图比AEAPMS的红外谱图多了一处在 1 652 cm-1的特征峰，该特征峰主要是由C=ONR振动引起的，这个典型的信号表明CDs表面成功钝化。为了深入了解CDs的光学特性，探究了CDs的UV-vis吸收光谱与荧光光谱。如图1c所示，合成得到的CDs在UV-Vis吸收光谱中显示出明显的特征吸收且集中在356 nm处，在荧光光谱中显示激发波长和发射波长分别是380 nm和463 nm。如图1d所示，在340～380 nm范围内激发时，CDs会在463 nm处显示出强烈的光致发光。随着激发波长的进一步增加，发射波长开始出现红移、光致发光强度降低和半峰全宽增宽的现象，这说明合成的CDs对激发波长具有依赖性。

图1 CDs的透射电镜图(a)；CDs和AEAPMS红外对比图(b)；CDs的UV-Vis吸收光谱、荧光发射谱和激发谱(c)；CDs在不同激发波长下的荧光光谱(d)

2.2 碳量子点的稳定性

为了更好的构建荧光探针，分析和讨论了CDs的稳定性。如图2a所示，CDs在紫外光下连续照射12 h后荧光强度变化幅度很小。如图2b所示，CDs处于较高的离子浓度下，其荧光强度变化幅度非常小。见图2c和图2d，在pH值为3～11的PBS和BR缓冲体系中，CDs的荧光强度均没有发生大幅度的变化。这写现象均表明CDs的荧光稳定性较强。通过滨松量子效率系统测试得到该碳量子点的量子产率为67%。

图2 激发时间对CDs荧光强度的影响(a)；n溶剂对CDs荧光强度的影响(b)；PBS体系中pH对CDs荧光强度的影响(c)；BR体系中pH对CDs荧光强度的影响(d)

2.3 条件优化

为了构建的荧光探针能更好的应用在检测咖啡酸当中，研究了分散溶剂对CDs荧光强度的影响以及反应时间对CDs-CA体系猝灭程度的影响。如图3a所示，CDs分散在超纯水中荧光强度是最大的。如图3b所示，加入咖啡酸溶液后，CDs的荧光开始猝灭，并在5 min内趋于平稳状态。因此，后续实验选择超纯水作为反应溶剂和反应时间选为5 min。

图3 分散溶剂对CDs荧光强度的影响(a)；反应时间对CDs-CA体系荧光猝灭程度的影响(b)

2.4 标准曲线

基于咖啡酸能使CDs发生荧光猝灭现象，构建一种用于检测咖啡酸的荧光探针。见图4a，在咖啡酸浓度为0.5～120 μM时，随着咖啡酸浓度的不断增加，CDs荧光强度不断下降。根据CDs的荧光猝灭强度和咖啡酸浓度的关系，绘制标准曲线。如图4b所示，标准曲线的校正方程为F0/F-1=0.007 1c+0.000 2。R2=0.999 36。方法的最低检出限为0.051 μM。与其他检测咖啡酸的方法相比，本研究方法有着更低的检出限或较宽的检测范围，详见表1。

表1 不同方法检测咖啡酸的比较

图4 咖啡酸浓度对CDs荧光强度的影响(a)和标准曲线(b)

2.5 选择性

为了验证CDs对咖啡酸具有选择性，将咖啡酸与一些常见阳离子(Na+、Mg2+、Ca2+)、糖类(葡萄糖、蔗糖)、氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、胱氨酸)进行比较。见图5，与其他物质相比，CDs在存在咖啡酸溶液时，荧光猝灭程度最高。这表明其他物质不能使荧光探针发生猝灭现象或者猝灭程度较小。

图5 不同物质对CDs的荧光猝灭效果相比

2.6 荧光猝灭机理的探究

为了探究荧光猝灭机理，分析CDs在存在和不存在咖啡酸情况下的UV-vis吸收光谱图。如图6a所示，CDs在356 nm处有吸收峰，CA在285～320 nm范围内有着吸收带。而当CDs加入CA后，出现了新的吸收峰。因此，推测是有基态复合物生成而导致荧光猝灭，该反应的猝灭机制可能是静态猝灭。为了进一步推断该反应的猝灭机制，故通过测定荧光寿命来判断猝灭机制。如图6b所示，τ0/τ≈1(τ0是CDs的荧光团的寿命，τ是引入猝灭剂(CA)后的荧光团的寿命)，因此，可以表明该反应的猝灭机制是静态猝灭。