耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌血流感染的临床特征及耐药分子分析

张泽智 徐佳

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是广泛分布于自然界的肠杆菌科一类中最重要的革兰氏阴性杆菌，其侵入人体后可在泌尿、呼吸、胃肠系统等部位定植，当宿主免疫力低下及免疫抑制时，KP 会大量繁殖并引起多种感染[1，2]。近年来，随着激素和广谱抗生素的广泛应用，加之临床侵入性操作、器官移植的增多，KP血流感染的病例逐年增多，已成为继大肠埃希菌后血流感染的第二大血流感染病原菌，也是医院感染的重要病原菌之一[3]。中国细菌耐药监测（2005～2022 年）结果显示，在此期间，KP 对美罗培南和亚胺培南的耐药率从2.9%、3.0%上升至27.4%、26.0%，主要原因是由于近年来耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的检出率逐年升高，检出的主要人群是接受介入治疗的恶性肿瘤及免疫功能低下患者，由于CRKP 高检出率大大增加了该检查群体的死亡率，使其已成为全球重大的公共卫生问题[4]。CRKP 的耐药机制十分复杂，由于其毒力强，感染患者往往病情较重，加之缺乏敏感的抗生素治疗，患者的死亡率高达60%，因此CRKP的耐药性是目前临床面临的难题之一[5]。目前国内关于CRKP 血流感染的临床特征及耐药机制的研究较少，为此，本研究进行了相关方面的分析，旨在为CRKP 血流感染患者的早期治疗和经验性用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及鉴定经承德医学院附属医院医学伦理委员会批准，选择2019～2022 年该院两院区住院患者为研究对象。纳入标准：体温＞38℃，血液标本培养分离出KP，并有以下症状之一：①有迁徙病灶或入侵门户；②肝脾肿大，有出血点或皮疹，外周血中性粒细胞增多伴核左移，但除血流感染外无其他原因解释；③无明显感染灶，但有全身中毒症状。排除标准：非血培养阳性标本，非KP 感染的血培养阳性标本。共纳入2 054 例KP 血流感染患者的病原菌标本，采用VITEK 2-Compact 全自动细菌鉴定仪，质控菌株为ATCC 700603，参照美国2019年实验室标准化协会改良Hodge 试验进行表型验证。排除重复菌株后有238 株 KP 确定为CRKP（CRKP 组），其中恶性肿瘤51 例，ICU 重症43 例，老年病47 例，其他疾病97 例。以性别、年龄1:1配对，选择238 例碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌（Carbapenem sensitive klebsiella pneumoniae，CSKP）感染患者作为对照组，其中恶性肿瘤48 例，心血管疾病43 例，脑血管疾病53 例，其他疾病94 例。

1.2 临床特征收集收集两组患者的临床资料，包括性别、年龄、基础疾病、采集标本前30d 是否有侵入性操作及留置导管（气管插管/气管造瘘、留置导尿管、中心静脉置管）、采集标本前30d 抗生素使用情况（单药、联合用药、碳青霉烯类抗生素、第三/四代头孢菌素）、临床转归（痊愈、好转/转院、死亡）。

1.3 药敏试验采用微量肉汤稀释法检测11 种抗菌药物，包括庆大霉素、左氧氟沙星、头孢西丁、阿米卡星、美罗培南、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、氨曲南对CRKP 的最低抑菌浓度。

1.4 碳青霉烯酶基因检测采用改良Hodge 试验筛选产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌表型。利用聚合酶链反应（PCR），以CRKP 基因组DNA 为模板，扩增菌株中碳青霉烯酶基因blaKPC、blaOXA-48、blaIMP、blaVIM、blaNDM。扩增产物双向测序后与GenBank 数据库进行比对，确定CRKP菌株携带的碳青霉烯酶基因。

1.5 多位点序列分型根据巴斯德研究所多位点序列分型（MLST）网站，分别以CRKP 菌株基因组DNA 为模板，扩增phoE、gapA、infB、mdh、pgi、rpoB、tonB七个管家基因后进行MLST。

1.6 统计学方法应用SPSS 19.0 软件，计数资料以n 和%表示，采用χ2检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征两组性别、年龄构成比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。CRKP 组患者入住ICU 的比例高于对照组，侵入性操作中留置尿管、留置引流管、手术、气管插管机械通气、中心静脉置管率高于对照组，使用抗生素类型中碳青霉烯类、β-内酰胺和 β-内酰胺酶抑制剂、糖肽类、替加环素使用率高于对照组，两种及以上抗生素联用率高于对照组，第三、四代头孢菌素使用率高于对照组，伴随心脑血管疾病、恶性肿瘤、感染性休克、肾脏疾病、烧伤患者的比例高于对照组，死亡率高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组患者临床特征比较 [n（%）]

2.2 耐药情况CRKP 组238 株菌株均为多重耐药菌，对庆大霉素、头孢西丁、美罗培南、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、氨曲南的耐药率均为100.00%，对阿米卡星、左氧氟沙星的耐药率最低，但也达81.09%、83.61%，对哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松的耐药率为89.92%、98.32%；耐药率均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组菌株对抗生素的耐药情况[n（%）]

2.3 碳青霉烯类基因检测238 株CRKP 菌 株Hodge 试验结果显示：阳性质控菌ATCC BAA 1705为227 株，占95.38%；阴性质控菌株ATCC BAA 1796 为11 株，占4.62%。227 株阳性质控菌ATCC BAA 1705 中162 株携带blaKPC-2基因，占71.37%；35 株携带blaNDM-1基因，占15.42%；11 株携带blaNDM-2基因，占4.85%；10 株携带blaOXA-48基因，占4.41%；9 株同时携带blaKPC-2基因与blaNDM-1基因，占3.96%；未检出携带blaIMP、blaVIM基因的菌株。

2.4 多位点序列分型按碳青霉烯酶基因比例选择79 株CRKP 菌株进行MLST 分型，共检测出13种ST 分型，其中ST11 分型最多，占62.03%，其次为ST15、ST1731、ST2230，分别占7.59%、6.33%、5.04%。分型占比情况见表3。

表3 79 株CRKP 菌株多位点序列分型构成

3 讨论

本研究结果显示，CRKP 组患者中入住ICU的比例高于对照组，接受侵入性操作中留置尿管、留置引流管、手术、气管插管机械通气、中心静脉置管率高于对照组；接受两种及以上抗生素联用率高于对照组，碳青霉烯类、β-内酰胺和 β-内酰胺酶抑制剂、糖肽类、替加环素使用率高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。在疾病构成方面，CRKP 血流感染患者的心脑血管疾病、恶性肿瘤、感染性休克、肾脏疾病、烧伤比例高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。说明这些因素是导致CRKP 检出率升高的重要原因。CRKP 血流感染患者的死亡率（53.78%）高于CSKP 血流感染患者（10.50%），差异有统计学意义（P＜0.05），提示CRKP 血流感染会大大增加患者的死亡率。CRKP与CSKP 菌株的药敏试验结果显示，CRKP 组238株菌株均为多重耐药菌，对庆大霉素、头孢西丁、美罗培南、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、氨曲南的耐药率均为100.00%，提示CRKP 多重耐药情况十分严重。在11 种抗生素中，耐药率最低的是阿米卡星和左氧氟沙星，但耐药率也达81.09%、83.61%，对哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松的耐药率为89.92%、98.32%，较高的耐药率会给治疗造成极大的困难。提示该院在疑似CRKP 血流感染患者抗生素经验性用药的选择上应规避耐药率高的抗生素。

产碳青霉烯酶是一类由基因编码合成的可分解碳青霉烯类抗生素，包括厄他培南、亚胺培南、美罗培南等的β 内酰胺酶[6～8]。本研究结果显示，238 株CRKP 菌株中227 例产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌表型阳性，说明产碳青霉烯酶是该院CRKP 耐药的重要原因。CRKP 携带的碳青霉烯酶基因具有地域差异，有研究显示，在重庆、陕西、湖南分离的CRKP 多携带blaNDM基因[6～8]。本研究结果显示，该院就诊患者中CRKP 菌株携带的碳青霉烯酶基因比例最高为blaKPC-2基因，占71.37%；而blaNDM-1基因仅占15.42%；9 株同时携带blaKPC-2基因、blaNDM-1基因，占3.96%；未检出携带blaIMP、blaVIM基因的菌株，与报道的重庆、陕西、湖南CRKP 携带碳青霉烯酶基因不同。分析原因可能是大多数blaKPC-2基因位于质粒上，可在多种人类最常见的病原微生物中播散耐药性，所以其能迅速传播的特性可能是检出率最高的重要原因之一。目前，已发现的KP 对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制有：①水解碳青霉烯类药物、产碳青霉烯酶；在碳青霉烯酶基因中最主要的是NDM-1、KPC-2、OXA-48。有报道[9～11]，在中国blaKPC-2ST11中流行主要与IncF 质粒介导的水平转移有关。②高亲和位点青霉素结合亲和力下降或蛋白数量不足。③高水平产头孢菌素酶/超广谱β-内酰胺酶同时合并外膜孔蛋白表达量不足或缺失[12～14]。④形成生物被膜。本研究多位点序列分型显示，ST11 分型最多，占62.03%，与国内CRKP 的主流克隆型一致，提示目前本地CRKP 菌株在遗传上相对保守[15]。除ST11 外，本研究还检出了ST15、ST1731、ST2230 等12 种ST 分型，虽然构成比例不高，但也可通过耐药质粒的传播产生耐药，因此，应对ST 型散发分型给予关注。

综上所述，CRKP 血流感染患者具有侵入性操作、伴随心脑血管疾病、恶性肿瘤及联合使用抗生素等特征。因CRKP 多重耐药情况严重，且对临床常用的抗生素高度耐药，所以给治疗造成极大的困难。CRKP 菌株主要为blaKPC-2基因型，ST11 是主要的流行克隆株，需要引起关注。