线粒体功能障碍在缺氧性肺动脉高压中的作用

潘舟，胡克

武汉大学人民医院呼吸与危重症医学科，武汉 430060

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是一种威胁生命的综合征，肺动脉压力 （pulmonary arterial pressure，PAP）的升高常导致呼吸困难和运动受限，最终发生右心衰竭。PH的病因和临床表现不尽相同［1］，世界卫生组织将PH 分为5 类：①动脉性PH（病理主要在肺血管）；②继发于左心疾病所致的PH；③慢性肺部疾病或低氧血症引起的PH；④慢性血栓栓塞性肺动脉高压；⑤多因素机制不明的PH，如溶血症或肉瘤病。鉴于诱发PH的原因众多，导致该疾病的发生机制存在相当大的异质性。由于线粒体在肺血管中起着氧感应作用，因此我们将讨论的重点放在缺氧性PH上。

线粒体作为通过氧化磷酸化产生ATP 的细胞器，能量生产只是其关键的作用之一，其还具有调节ROS 产生、线粒体的生物生成、融合和裂变、有丝分裂和钙平衡的非常规功能［2］，与肺循环中的细胞功能高度相关。线粒体功能障碍主要包括线粒体ROS 产生、线粒体能量代谢重编程、线粒体质量控制异常以及线粒体动力学和钙调控的异常。本文总结了缺氧诱导的线粒体功能障碍在PH发病中的作用，深入了解线粒体在肺动脉高压中的代谢、分子和生理作用，有助于开发针对线粒体的治疗策略，以减缓或逆转肺动脉高压的进展。

1 线粒体信号的产生

线粒体中的氧气利用主要发生在电子传递链（electron transfer chain，ETC）复合体Ⅳ上。在这个部位，O2作为电子传递链的终端电子受体，形成H2O。然而，沿着ETC 有多个位点可以发生电子泄漏。在这个过程中，一个电子被O2接受，形成一个超氧化物自由基，通过超氧化物歧化酶的作用迅速转化为H2O2。线粒体中有多个超氧化物产生位点，包括ETC 中的复合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，以及某些非ETC 线粒体脱氢酶［3］。然而，在缺氧情况下复合物Ⅰ和复合物Ⅲ的位点会产生大部分的线粒体ROS（mitochondria ROS，mtROS），mtROS信号是多种细胞功能所必需的，如分化、增殖和对包括缺氧在内的各种应激的适应［4］。线粒体对于维持由三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环和线粒体膜电位介导的生物合成和生物能量途径至关重要。其中，TCA 循环会产生NADH 和FADH2，它们将电子转移到ETC 的还原等价物上，而线粒体通过释放ROS 和TCA 循环代谢物作为信号传递细胞器。

2 缺氧性肺血管收缩

缺氧性肺血管收缩（hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV）是肺将血流灌注与通气相匹配以优化全身氧气输送的内在机制，反映了肺内小动脉对肺泡缺氧的反应。HPV 可以是全身性的，也可以由局灶性肺不张或肺炎引起，肺泡缺氧和血管收缩都局限于肺段或肺叶内。在这种情况下，血液从缺氧的肺段转移到氧合较好的肺部，而不会引起PAP 升高［5］。除了发生PH 和不可逆的血管重塑外，HPV 在气道氧水平恢复正常后是可逆的。1 名支气管内腺瘤患者在切除腺瘤后长期存在的左肺不张和通气/灌注比值异常恢复到正常水平，表明持续性HPV 在气道氧水平恢复正常后是可逆的［6］。肺动脉对缺氧的血管收缩反应比较特殊，缺氧会导致肾动脉、肠系膜动脉和脑动脉等其他全身血管系统扩张，从而有助于增加组织氧输送。肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）对HPV 的独特性表现部分与线粒体功能的空间异质性和离子多样性有关。

HPV 的核心效应机制在于PASMCs 能独特地感知生理性缺氧，并以ROS 产生的动态变化作出反应，同时涉及细胞内电压和化学敏感性的钾和钙通道的协调反应［5］，如图1 所示。常氧情况下，电压门控的钾离子通道（Kv）保持着约-60 mV 的静息膜电位，这种负的膜电位降低了电压门控中L 型钙通道的开放。在缺氧期间，mtROS 的增加抑制Kv通道，导致细胞膜去极化和向外的钾电流被抑制，增加了钙通道的开放概率，导致细胞外Ca2+顺浓度梯度流入细胞内，同时低氧诱导了Ryanodine 受体（ryanodine receptor，RyR）的激活和肌质网内Ca2+的释放，也会使细胞质Ca2+浓度上升和随后的Rho 激酶介导的钙敏化，从而导致肺动脉（pulmonary artery，PA）收缩［7］。除了Ca2+通道敏感性的变化，慢性缺氧还导致K+通道表达下降，以及瞬时受体电位C 通道蛋白表达上调，这与钙库调控的钙离子通道活动有关［8］。胞质Ca2+浓度的增加导致PASMCs的收缩、增殖和肺血管重塑。因此，慢性缺氧和持续的HPV可导致肺血管阻力增加、肺血管重塑以及PH。

图1 缺氧性肺血管收缩的信号传递Fig. 1 Signaling pathways in hypoxia-induced pulmonary vasoconstriction

3 缺氧诱导的线粒体功能障碍

3.1 mtROS产生的异常

最初由Archer等［9］提出的关于HPV的氧化还原理论认为，由于氧气供应的减少，肺动脉平滑肌细胞线粒体ETC 产生的mtROS 也会减少。当时因实验技术与实验试剂的限制，用于测量ROS 的荧光试剂不能穿透细胞膜，他们在缺氧期间检测到的化学发光减少，这反映了线粒体ROS 生成的减少，也提示细胞外超氧化物水平的下降。目前，已有大量证据表明缺氧会引起线粒体ROS 的增加，从而引发HPV［10］。Guzy 等［11］使用基于FRET的氧化还原传感器证明了急性缺氧后ROS 的增加。Waypa 等［12］将ROS 敏感蛋白靶向到PASMCs的特定亚细胞区间，利用蛋白被氧化产生荧光的强弱来评估ROS 的水平，结果显示在缺氧期间，线粒体基质中的ROS 有所减少，而线粒体膜间空间和细胞膜中的ROS 明显增加。已有研究证明，Rieske 铁硫蛋白（Rieske iron-sulfur protein，RISP）蛋白是复合体Ⅲ在缺氧时产生ROS 的必要条件，抑制PASMCs 中的RISP 能够减少缺氧引起的线粒体膜间空间mtROS，同时增加细胞内Ca2+的浓度［11］。

3.2 线粒体代谢重编程

脯氨酰羟化酶在常氧下利用O2使缺氧诱导因子-α（hypoxia-inducible factor-α，HIF-α）羟化，然后通过连接复合物酶使其泛素化降解。而这个过程在缺氧状态下被抑制，促使HIF-α 稳定存在，并与HIF-β 形成二聚体，从而驱动HIF 依赖的信号传导。HIF-α 稳定介导代偿性糖酵解重编程，促进葡萄糖转运蛋白1、己糖激酶和乳酸脱氢酶的表达，促进葡萄糖的产生［13］。同时，由于丙酮酸脱氢酶激酶升高，丙酮酸激酶异构体M2 的活性增加，这会抑制磷酸烯醇式丙酮酸产生丙酮酸的速度，并降低丙酮酸脱氢酶的活性，从而表现出氧化磷酸化减少和糖酵解增加的Warburg 效应［14］。在慢性缺氧的大鼠PASMCs 中观察到磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，PPP）的限速酶葡萄糖6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）活性以及PPP 通量的增加［15］。此外，谷氨酰胺的分解以及脂肪酸氧化过程的变化也参与了缺氧诱导的线粒体功能障碍的代谢重编程。

3.3 线粒体质量控制的异常

线粒体是高度动态的细胞器，其在细胞中不断地进行融合和裂变。例如，DRP1蛋白主要介导线粒体的裂变，而MFN1、MFN2、OPA1则介导线粒体融合。MFN1 或MFN2 的过表达及功能缺陷会导致不同程度的线粒体网络分裂，引起线粒体功能障碍［16］。在缺氧等应激情况下，线粒体E3泛素蛋白连接酶和MARCH5蛋白通过调控MFN1的乙酰化降解，从而影响MFN1 的水平［17］。同时在应对缺氧等应激时，MFN2 被JNK 蛋白磷酸化，导致MFN2 的泛素化降解和线粒体的分裂［18］。此外，低氧诱导HIF1-α的激活也会增加DRP1蛋白的表达，促进线粒体裂变。线粒体融合的减少也是造成PH 中线粒体过度破碎的原因。而由于缺氧引起的损伤线粒体增加，也会一定程度地导致线粒体自噬的增加［19］。线粒体自噬也通过降解受损或多余的线粒体参与线粒体的质量控制［20-21］。

3.4 线粒体钙调控异常

缺氧导致PASMCs中Ca2+迅速增加，使得平滑肌收缩。如上所述，缺氧后诱导的mtROS 增加抑制了Kv 通道，导致细胞膜去极化，这促使电压依赖性Ca2+通道的开放［22］。同时，缺氧还可以引起其他Ca2+通道的开放。mtROS 激活PASMCs 中的RyRs，诱导肌浆网中Ca2+的释放［23］。H2O2也可以通过激活三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）敏感的细胞内磷脂酶C，产生二酰甘油（diacylglycerol，DAG）和IP3。其中，DAG 通过激活配体门控钙通道诱导胞内Ca2+浓度的增加［24］，IP3 受体的激活诱导肌浆网中Ca2+的释放会导致钙库调控的钙离子通道的开放。

4 PH与线粒体功能障碍

4.1 PH与mtROS产生的异常

目前，人们普遍认为缺氧和由此产生的PH与高水平的氧化应激有关。Dorjgochoo 等［25］观察到PH 患者的尿液中代表ROS 水平的氧化应激敏感性标志物比对照组高出2~3 倍。同样，在特发性肺动脉高压患者和缺氧诱导的PH 大鼠血浆中，由氧化应激引起的脂质氧化的化合物丙二醛浓度更高［26］。在内皮细胞中，也发现了脱氧核糖核酸氧化的标志物8-羟基脱氧鸟苷水平的增加［27］。

此外，缺氧引起mtROS 的增加介导了HPV 反应。例如，在急性缺氧期间，PASMCs细胞中mtROS水平升高，诱导胞质内Ca2+的积累，引起肌球蛋白轻链磷酸化，最终导致PASMCs 的收缩［28-29］。线粒体ETC 复合体Ⅲ上的RISP 蛋白对于缺氧引起的mtROS 产生至关重要。与野生型小鼠对比，PASMCs特异性敲除RISP蛋白的小鼠在缺氧条件下mtROS 的生成和细胞质内Ca2+浓度的增加受到明显抑制。同时，在体外利用H2O2对从这些小鼠分离的肺动脉进行处理，导致H2O2浓度依赖性收缩，证实了mtROS 在缺氧引起的血管收缩中的作用［30-31］。最近有研究表明，在小鼠缺氧模型中，过表达超氧化物歧化酶通过增加小鼠肺内H2O2的水平从而加剧缺氧诱导的PH；相反地，过表达线粒体靶向过氧化氢酶能够通过促进H2O2的分解缓解缺氧诱导的小鼠PH［32］。这些数据都表明线粒体H2O2作为中间信号分子在介导PH 血管功能障碍中发挥重要作用。mtROS的增加可能导致炎症、肥大、细胞增殖及内皮功能障碍，最终导致PH［33］。因此，对mtROS的产生及下游信号通路的研究，将为临床治疗缺氧性PH提供基础。

4.2 PH与线粒体代谢重编程

在缺氧诱导的实验性PH 模型中出现氧化磷酸化减弱、糖酵解增强的Warburg 代谢现象。二氯乙酸盐（dichloroacetate，DCA）是一种代谢调节剂，可以抑制丙酮酸脱氢酶激酶异构体，增强丙酮酸脱氢酶活性，从而增加丙酮酸/乳酸的比例，恢复慢性缺氧性PH大鼠中PASMCs的葡萄糖氧化［34］。此外，通过促进氧化磷酸化，DCA 增加了PASMCs的全细胞K+外向电流，增强了Kv2.1 通道的表达，从而缓解了缺氧性PH。在实验性PH 大鼠的PASMCs 中，Kv1.5 和Kv2.1 通道的表达下降，导致膜去极化、钙超载和抗凋亡表型。而DCA 能够促进Kv1.5 通道的表达，增加PASMCs 细胞凋亡/增殖的比例，改善肺动脉肥厚［35］。基于上述动物研究，Michelakis 等［36］在1 期临床试验中测试了DCA的疗效，结果发现在与治疗PH 基础药物联用的基础上，DCA 治疗4 个月后能够显著降低平均肺动 脉 压（mean pulmonary artery pressure，mPAP）（治疗前49±3 mmHg、治疗后45±3 mmHg，P<0.05），降低肺血管阻力，并提高6 min 步行测试时间（治疗前400±28 m、治疗后425±23 m，P<0.05）［36］。雷诺拉嗪和曲美他嗪这2 种药物均能部分抑制脂肪酸氧化，促进葡萄糖氧化，从而更有效地利用氧气［37］。PH 中肺血管阻力增加导致右心室（right ventricle，RV）压力增加。然而，主动脉压力通常不变或降低，这降低了血流对右冠状动脉灌注，导致RV 缺血。因此，雷诺拉嗪和曲美他嗪可被用于治疗PH中的RV功能障碍。

在多种PH 模型中，PPP 通量在肺血管细胞中上调。例如，在长期缺氧大鼠PASMCs 中观察到限速酶G6PD 活性增加，表明G6PD 的缺乏可能保护了PH 的发展［15］。增加的PPP 通量提供了抵抗氧化应激和快速生长所需的底物。因此，抑制G6PD 酶活性可能是抑制PASMCs 过度增殖的潜在治疗靶点。然而，G6PD 的缺失也减少了NADPH 的产生，这可能对PH 的血管运动张力不利。目前，在PH中针对异常的PPP是否有治疗效果尚不清楚。谷氨酰胺分解能够补充TCA 循环的碳中间体，有助于氨基酸、脂肪酸以及嘌呤和嘧啶的合成。新数据也支持谷氨酰胺代谢异常在PH中有明显的致病作用。有研究表明，在谷氨酰胺酶1 介导的谷氨酰胺转化中，谷氨酸的升高会刺激NMDA 型谷氨酸受体，诱导肺血管中谷氨酸发生细胞-细胞信号的传导并促进PH，抑制谷氨酰胺分解的同时也能够有效缓解实验性肺动脉高压［38］。

4.3 PH与线粒体质量控制异常

在PH患者的PASMCs中已经证实了DRP1介导线粒体裂变的增加［39］。体内外试验表明，抑制DRP1 能够促进PASMCs 中线粒体网络的形成，抑制PASMCs 的增殖，降低肺动脉压力，缓解肺小动脉的重塑［39］。因此，缺氧诱导的线粒体裂变通过加速细胞周期的进展促进PH 的发展，而抑制DRP1 具有一定的治疗潜力。线粒体融合的减少也是造成PH 中线粒体过度破碎的原因。研究表明MFN2的表达在PH 患者及大鼠PH 模型的肺血管组织中下降［40］。同样，在实验性PH 的肺组织中也发现MFN2 表达降低，表明MFN2 介导的线粒体融合减少是促进PH 发生与发展的一个重要机制。在PASMC 中过表达MFN2 会增加线粒体融合，抑制细胞的增殖并诱导凋亡。

生物体为了维持一个最佳的功能网络，需要不断地进行线粒体周转，以线粒体自噬的形式清除功能失调和受损的线粒体。PGC-1α 通过激活NRF1 和线粒体转录因子来促进线粒体生物生成。在PH 患者和实验性PH 中，PGC-1α、ETC 亚单位和mtDNA 拷贝数的表达减少，线粒体生物生成减少［41］。另一项研究表明，缺氧诱导内皮细胞特异性敲除BMPR2 的小鼠出现PH，并表现出线粒体生物合成的抑制、mtROS 的增加和线粒体膜电位的降低［42］。另外，在暴露于间歇性缺氧的小鼠中，内皮细胞解耦联蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）的缺失会增加线粒体自噬，抑制线粒体生物生成，从而增加肺动脉内皮细胞（pulmonary artery endothelial cells，PAEC）的凋亡。另外，研究发现抑制FUNDC1介导的线粒体能够一定程度上减轻缺氧诱导的肺动脉高压［43］，这表明过度的线粒体自噬也会促进缺氧性肺动脉高压的发展。

4.4 PH与线粒体钙调控异常

RyRs 激活促进肌浆网中Ca2+的释放，是引起缺氧性肺血管收缩的主要因素。Li等［44］研究发现小鼠RyRs蛋白的缺失会抑制缺氧诱导的PASMCs中Ca2+浓度的增加以及肺血管收缩。同时，Kinnear 等［45］报道了大鼠PASMC 内RyRs 的空间异质性，其中RyR3 在核周区域较多，溶酶体和富含RyR3 的肌浆网在该区域的聚集为烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸盐诱导的Ca2+信号提供了一个触发区。这种现象以及RyR 亚型的空间分布可能对HPV的Ca2+信号传导有重要影响。

另外，线粒体内Ca2+浓度的增加可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。在心肌细胞中过量表达UCP2 可抑制钙流入线粒体并减少ROS 的产生。UCP2的缺失抑制了内质网到线粒体的钙通量，进而使释放到胞质的钙离子增加［46］。Sutendra 等［47］发现，缺氧通过激活内质网应激转录因子ATF6，促进PASMCs中内质网结构调节蛋白Nogo-B的表达，Nogo-B 的升高能够增加内质网和线粒体之间的距离，从而减少内质网到线粒体的磷脂和钙转移，使释放到胞质的钙离子增加。Ca2+从内质网进入线粒体的主要途径是由位于线粒体内膜上的线粒体钙单向转运蛋白所介导的。在PH 和癌症患者中，发现线粒体钙单向转运蛋白的表达下降，胞质Ca2+浓度增加而线粒体Ca2+浓度下降，从而抑制丙酮酸脱氢酶活性。

5 展望

线粒体在复杂的肺部生物学中的作用正受到越来越多的关注，缺氧诱导的线粒体功能障碍能明确促进PH 的发生与发展，但目前的治疗方法并不能针对线粒体功能障碍和代谢失调引起的异常。在许多临床前研究和一些早期临床试验中，针对PH 患者中线粒体功能障碍的药物已取得了一些预期的结果。深入研究线粒体在肺循环中的非典型功能及其响应缺氧的作用机制，探究线粒体在调节氧化还原信号、细胞周期、细胞凋亡以及线粒体质量控制等方面的作用，为开发线粒体靶向治疗策略提供更深入、全面的基础，有望通过改善PH患者的线粒体功能障碍而缓解PH。未来还需要更严谨科学的临床前和临床研究来评估这些新疗法的安全性和治疗价值。