一种特异性靶向神经节神经元的基因递送技术

陈紫悦 刘 帅 杜婉洁 童 芳 王芸芸 华领洋 宫 晔， 韩清见△

（1复旦大学脑科学研究院-医学神经生物学国家重点实验室 上海 200032； 2复旦大学脑科学前沿科学中心 上海 200032；3复旦大学附属华山医院重症医学科， 4神经外科 上海 200040）

周围神经系统（peripheral nervous system，PNS）对于哺乳动物的生命活动必不可少，它调控着腺体的分泌，胃肠道的蠕动，呼吸和心跳，是外周器官和中枢神经系统连接的桥梁［1-2］。在解剖学上，PNS 由感觉神经和运动神经这两类神经组成。感觉神经可进一步分为躯体感觉神经和内脏感觉神经，前者的胞体位于背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）或三叉神经节（trigeminal ganglion，TG）中，后者的胞体位于颈静脉神经节、DRG 或TG 中［3］；运动神经由胞体位于脊髓前角的躯体运动神经和内脏运动神经组成。内脏运动神经也称为植物神经，包括交感神经和副交感神经。交感神经节后神经元的胞体聚集在脊柱旁的交感神经节（sympathetic ganglion，SG）中，而支配内脏的副交感神经节神经元的胞体则位于迷走神经节（nodose ganglion，NG）中［3］。然而，由于这些神经节体积小，分布分散，结构致密，加之已知分子标记有限，利用现有的病毒或转基因工具很难特异性操纵这些神经节中的神经元。

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是一种无包膜的单链线性DNA 病毒，属于依赖细小病毒属，不能独立复制。其直径约为20 nm，基因组大小约为4.7 kb，末端有145 个碱基组成的反向末端重复序列（inverted terminal repeats，ITRs）［4-5］。 自1982 年重组AAV2 首次建立以来，因其多样化的优势得以广泛用于动物体内实验，以将外源基因转移到动物细胞和组织中［6-7］。目前已发现100 多种AAV 变体，神经科学研究中常用其血清型1、2、5、6、8、9。由于其具有组织嗜性，不同血清型的AAV对同一组织的感染效率存在较大差异［8-9］。此外，AAV 的递送方式也会影响AAV 介导基因的转移效率。有研究表明，鞘内注射重组AAV 在脊髓中的感染效率比外周器官高10 倍，而静脉注射则相反［10］。因此，除了适当的AAV 血清型和启动子启动靶基因外，优化的递送方式可以取得更好的感染效果。

近年来，研究人员开发了多种AAV 传递到DRG 神经元的方法，如鞘内注射、DRG 注射、神经内注射AAV2/6，AAV5，AAV6，AAV8，AAV2/9［11-13］。虽然这些方法感染效率高，但侵入性手术往往导致神经周围组织或初级感觉神经元创伤，严重干扰疼痛测试或其他行为测试。皮下注射、肌内注射AAV2/6 基本无创，但DRG 神经元感染效率较低，阻碍了其进一步应用［14］。P0 小鼠腹腔注射AAV2/9可将基因转移到DRG 神经元，感染效率又高［15］，但在其他神经节、中枢神经系统、肠神经系统和内脏器官的感染特异性尚不明确。

我们对出生0 天的小鼠腹腔注射AAV2/9，发现仅外周神经节神经元被特异性感染，如DRG 神经元、TG 神经元、NG 神经元和SG 神经元，而内脏、神经胶质细胞、脑和脊髓神经元以及肠神经系统很少被感染。这一发现为我们提供了一种将基因或shRNA 递送到神经节神经元的有效途径。

材 料 和 方 法

实验动物C57BL/6 小鼠购自上海灵畅生物科技有限公司，分组饲养于复旦大学实验动物科学部，光照12 h/黑暗12 h，温度（22±1） ℃，自由获取食物和水。未预先计算样本量，样本量的选择基于我们先前类似的研究［16-17］，即组织学实验所用小鼠每组不少于3 只，行为学实验所用小鼠每组不少于5 只。所有动物实验程序均经复旦大学基础医学院实验动物伦理委员会批准（批准号：20211018-002），并按照国家卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。

P0 小鼠腹腔注射腹腔注射采用P0-P1 小鼠。注射前须将小鼠膀胱内的尿液排尽，可用右手示指轻轻按压小鼠腹部，并向尿道方向推数次，直到不再排出尿液。然后用左手固定小鼠，使小鼠呈仰卧位，暴露出腹部。右手持针，将针尖从小鼠右后肢上许处慢慢插入。待看见针尖全部没入腹腔后推针，注射完成后缓慢拔出针头，并轻微旋转防止漏液。AAV 病毒滴度为（2～5）×1012vg/mL，注射剂量为10 μL。本研究所用病毒为pAAV-CAG-MCSEGFP-3FLAG［和元生物技术（上海）股份有限公司 ， AOV002］ 和 pAAV-CAG-hChR2-H134RtdTomato-WPRE-pA（上海泰儿图生物科技有限公司，6253357）。

免疫组织化学免疫染色如文献所述［16，18］。取样小鼠深度麻醉后，经升主动脉灌注1×PBS 和4%多聚甲醛（上海-国药集团化学试剂有限公司，80096618）。取下组织和器官，4%多聚甲醛中4 ℃固定过夜，蔗糖（美国Sigma 公司，V900116）梯度脱水，然后在冰冻切片机（德国徕卡公司）上切成连续横切面。切片厚度：脑和脊髓为30 μm，DRG、TG、NG、SG、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胰腺、皮肤、肺和肠为14 μm。用封闭缓冲液（1×PBS 配制：含10%山羊血清，美国Gibco 公司，16210072 ；0.1% Triton X-100，上海国药集团化学试剂有限公司，30188928）在37 ℃下封闭45 min，然后与一抗在4 ℃孵育过夜。本研究中使用的一抗如下：鼠抗NF200（1∶1 000，美国Millipore 公司，N2912），兔抗CGRP（1∶1000，美国Millipore 公司，C8198），兔抗TH（1∶1 000，美国Millipore 公司，ab152），兔抗GS（1∶1 000，英国Abcam 公司，ab49873）和兔抗P2X3（1∶1 000，美国Neuromics 公司，RA10109）。之后用1×PBS 洗涤，并与二抗在室温下孵育2 h。使用的二抗如下：驴抗鼠IgG Alexa Fluor 555（美国Invitrogen 公司，A-31570，1∶400）和驴抗兔IgG Alexa Fluor 555（美国Invitrogen 公司，A-31572，1∶400）。DAPI（美国Invitrogen 公司，D1306，1∶1 000）用于标记细胞核，Nissl（美国Invitrogen 公司，N21479，1∶500）用于标记神经元的胞体。1×PBS 洗涤后滴加固体封片剂封片，晾干后用激光共聚焦显微镜（日本尼康株式会社）扫描并采集图像。

行为学测试疼痛行为测试按照纪如荣教授实验室发表的方法进行［19］。使用波长为470 nm 的蓝光（光电测量仪器，千奥星科南京生物科技有限公司）刺激小鼠后爪10 s。光强范围为1～2.5 mW，刺激频率为2 Hz、5 Hz 和10 Hz，间隔2 min。所有行为均用摄像机（日本佳能株式会社）记录并回放。在小鼠接受单次刺激后10 s 内计算小鼠抬、举、抖、舔和跳的总时间。

离体DRG 膜片钳记录取样小鼠麻醉后断头处死，暴露出脊髓与DRG。快速分离DRG 用酶混合物（DNA 酶：0.1 mg/mL，DN25；胰酶：0.4 mg/mL，T8003；胶原酶：1 mg/mL，C9891；均为美国Sigma公司产品）在37 ℃下消化45 min。1 200 r/min 离心（离心半径为8.4 cm）2 min（高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司，5424R）后用neurobasal 培养基（Gibco，10888022；含 10% 胎牛血清：Gibco，10091148；2% 双抗：Gibco，15140122；2%B27：Gibco，17504044；均为美国Thermo Fisher Scientific公司产品）重悬细胞，吹吸混匀，通过100 μm 细胞过滤器（上海拓然生物科技有限公司，122104）制成单细胞悬液。接种在细胞爬片（世泰实验器材有限公司，10211818C）上，于37 ℃，5% CO2培养箱（美国Thermo 公司）中培养。使用Axopatch-700B 放大器和1550B 数模转换器（美国Axon Instruments 公司）在室温下进行全细胞膜片钳记录，使用波长为483 nm 的蓝光刺激离体DRG 神经元，记录不同频率（1、2、5、10、20 Hz）下的内向电流和膜电位变化情况。数据采集和分析使用pClamp 10（美国Axon Instruments 公司）。

定量和统计分析所有数据均用±s表示。柱状图中的点表示每只小鼠或每张图像的单个值，水平线表示平均值。使用Prism 8.0 进行统计分析，采用双因素方差分析（two-way ANOVA）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 感染神经节神经元为了探究AAV2/9 对神经节神经元的感染效率，我们于2 个月后处死P0 腹腔注射AA2/9-EGFP 的小鼠取材，并检测了EGFP 在DRG、NG、TG 和SG 中的表达。结果显示，69.11%±1.42%的DRG 神经元，32.46%±1.81%的NG 神经元，7.08%±1.16%的TG 神经元和4.76%±0.29%的SG 神经元被感染（图1A～C）。此外，神经节内的卫星胶质细胞（图1D）、固有免疫细胞或内皮细胞很少被感染。这些数据表明，AAV2/9 通过腹腔注射给P0 小鼠可感染神经节神经元，并趋向感染DRG 和NG 中的神经元。

图1 免疫荧光检测P0 腹腔注射AAV2/9 小鼠各神经节中EGFP 的表达Fig 1 Immunofluorescence detection of EGFP expression in the ganglia of mice injected with AAV2/9 intraperitoneally at P0

P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 感染DRG 神经元时无细胞类型特异性DRG 由许多不同类型的神经元组成［20］，可通过免疫染色不同的分子标记物来区分。降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）可标记肽能神经元；三磷酸腺苷受体P2X3可标记非肽能神经元；神经丝重链200 可标记大直径和有髓鞘的低阈值机械感受器（low threshold mechanoreceptors，LTMRs）或 Aδ/Aβ -LTMRs；酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）可标记小直径C 纤维-LTMRs［20］。结果显示，17.05%±1.24% 的EGFP+神经元表达CGRP，27.95%±1.57%的EGFP+神经元表达P2X3，18.00%±1.60%的EGFP+神经元表达NF200，9.15%±1.78% 的EGFP+神经元表达TH（图2A～B）。此外，50.08%±2.22% 的CGRP+DRG 神经元，55.66%±2.79% 的P2X3+DRG 神经元，53.25%±3.33%的NF200+DRG神经元和41.15%±6.93%的TH+DRG 神经元表达EGFP（图2A、2C）。这些结果表明，P0小鼠腹腔注射AAV2/9 可以高效感染神经节神经元且无神经元亚型偏好。

图2 免疫荧光检测P0 腹腔注射AAV2/9 小鼠DRG 中不同神经元标记物的表达Fig 2 Immunofluorescence detection of the expression of different neuronal markers in DRG of mice injected with AAV2/9 intraperitoneally at P0

P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 对中枢神经系统神经元感染效率极低为了探究P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 是否特异性感染神经节神经元，我们检测了2 月龄小鼠全脑和不同脊髓节段中EGFP 的表达。结果显示，在海马区（hippocampus，HIP）和初级躯体感觉皮层（primary somatosensory cortex，S1）中只有少数神经元是EGFP+，而在在薄束核、前庭核和苍白球等切面中，只能检测到EGFP+神经纤维，未检测到神经元胞体（图3）。在脊髓的不同节段，如颈段、腰段和骶段，神经元胞体聚集的灰质中仅检测到EGFP+纤维。这些纤维主要分布在脊髓背侧，可能是被感染的DRG 神经元向中枢的投射。白质中存在大量EGFP+神经纤维，特别是在楔束和薄束上行的后索中（图4A、4B）。这些纤维是DRG中低阈值机械感受器向中枢的投射，编码纹理和精细触觉［21-22］。此外，我们还检测了皮肤中的感染情况，同样发现只有EGFP+的神经纤维，局部的皮肤细胞或免疫细胞则都未被AAV2/9 感染（图4C）。这些数据表明，P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 可特异性感染神经节神经元，特别是DRG 和NG。

图3 免疫荧光检测P0 腹腔注射AAV2/9 小鼠脑中EGFP 的表达Fig 3 Immunofluorescence detection of EGFP expression in the brain of mice injected with AAV2/9 intraperitoneally at P0

P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 可用于操纵DRG 神经元近年来，化学遗传学和光遗传学都已广泛应用于神经科学领域［23］。我们对P0 小鼠腹腔注射了AAV2/9-ChR2（H134R）-Tdtomato，病毒滴度为5×1012vg/mL， 使 光 敏 感 通 道 蛋 白（channelrhodopsin-2，ChR2）［24-25］特异性感染DRG 中的伤害性感受器。小鼠成年后，我们取DRG 神经元离体培养，当用483 nm 的蓝光照射时，被感染的DRG 神经元自发荧光（图5A）。用不同频率（1、2、5、10、20 Hz）的蓝光刺激，均可诱导出DRG 神经元的内向电流和膜电位变化（图5B）。同时，我们还进行了疼痛行为测试，将小鼠后爪暴露于不同强度和刺激频率的蓝光10 s，这些小鼠出现了光强度和刺激频率依赖性的疼痛反应，包括退缩、抬爪、舔舐行为（图5C）。这些数据表明，P0 小鼠腹腔注射时，伤害性感受器被AAV2/9 感染并表达ChR2，该方法可用于疼痛研究。此外，对于一些特异性表达Cre的小鼠，可以通过化学遗传学或光遗传学来操纵DRG 神经元的不同亚群，研究它们在疼痛信号传递中的作用和机制。

P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 对内脏器官感染效率极低我们检测了小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠等脏器细胞的感染情况。结果显示，在肾脏、脾脏、胰腺和肠道中几乎未检测到EGFP+细胞（图6A～6D），但在结直肠周围发现了一些EGFP+神经纤维（图7D）。此外，有少量的肝细胞、肺细胞和心肌细胞被感染（图7A～7C）。

图6 免疫荧光检测P0 腹腔注射AAV2/9 小鼠肾等外周器官中EGFP 的表达Fig 6 Immunofluorescence detection of EGFP expression in peripheral organs such as kidney of mice injected with AAV2/9 intraperitoneally at P0

图 7 免疫荧光检测P0 腹腔注射AAV2/9 小鼠肝等外周器官中EGFP 的表达Fig 7 Immunofluorescence detection of EGFP expression in peripheral organs such as liver of mice injected with AAV2/9 intraperitoneally at P0

为了进一步验证我们的结论，我们采用了不同数量级的病毒滴度观察比较，分别为稀释后的5×1010vg/mL、5×1011vg/mL 以及病毒原液1.4×1013vg/mL。P0 小鼠腹腔注射4 周后灌流取材，切片染色。结果显示，当注射剂量统一为10 μL、病毒滴度为5×1010vg/mL 时，各外周神经节神经元、中枢系统神经元、皮肤和内脏器官几乎无感染（附图1）。当病毒滴度为5×1011vg/mL 时，AAV2/9 感染模式与前述一致，不过感染效率较低且绿色荧光微弱（附图2），虽然我们在采集图像时可以通过提高激光强度与增益来提高显示的荧光亮度，但较低的感染效率不利于后续实验的开展。当病毒滴度为1.4×1013vg/mL 时，绿色荧光明显，感染模式与前述基本一致，但过高的病毒滴度不仅价格昂贵，而且可能出现非特异性感染（附图3）。综合考虑，我们进行P0 小鼠腹腔注射AAV 时，选取了1012数量级，实验结果良好且效益最大。

总之，这些数据表明，在P0 小鼠上腹腔注射AAV2/9 可以特异性感染神经节神经元，尤其是DRG 神经元和NG 神经元。这为我们研究这些神经元中的基因表达的作用和机制，以及DRG 或NG对其他器官的调控提供了有力的工具。

讨 论

周围神经系统是连接外周器官和脑的纽带，调节着众多的生命过程，其胞体主要聚集在神经节中，如DRG、TG、NG 和SG 等［26-29］。神经科学家，免疫学家和细胞生物学家越来越关注神经系统与其他器官之间的相互作用，因此迫切需要开发新的工具或方法，将基因、shRNA 或其他基因修饰工具专门传递到这些神经节的神经元中。这将使我们能够轻松地操纵这些神经元来研究它们本身及其与外周器官的相互作用。AAV 介导的基因转移为我们提供了一种强有力的工具，以血清型嗜性的方式将基因或shRNA 有效递送到多种组织和细胞类型中［30］。然而，分散的位置和紧凑的结构使得它们很难被病毒介导的基因转移靶向［26，31-32］。 在本项研究中，我们建立了一种新的方法，即在P0 小鼠腹腔内注射AAV2/9［滴度为（2～5）×1012vg/mL，剂量=10 μL］。该方法能特异性感染神经节神经元，但很少影响外周器官或中枢神经系统的神经元。这使得在这些神经节神经元中特异性过表达或敲低某种基因，或者使用光遗传学或化学遗传学工具以研究它们与其他器官的相互作用成为可能。

为了将基因或shRNA 递送到DRG 神经元，目前已经有几种途径，包括系统性注射（如静脉注射）和局部注射（如鞘内注射，DRG 注射，神经内注射）。然而，这些递送方法的局限性严重阻碍了其靶向DRG 神经元的使用。直接DRG 注射、神经内注射和鞘内注射可导致18%～48%的高感染效率［33-34］，但这些侵入性方法往往导致神经损伤，严重干扰后续的行为测试［33］。对P0 小鼠腹腔注射AAV 是无创的，感染率达到约70%，显著高于以往的方法（图2）。

我们也检测了其他神经节神经元的感染情况，结果表明只有7.08%的TG 神经元和4.76%的SG神经元被感染，而有超过30.46%的NG 神经元被感染（图1）。今后可以利用这种方法并结合光遗传学，研究NG 神经元中表达的基因功能以及副交感神经在调节外周器官中的作用。我们还检测了AAV 在脑和脊髓中的感染情况，结果显示脊髓和脑中感染的局部神经元很少。有趣的是，我们在脊髓不同节段背角的浅层和深层以及背柱中都发现了大量的EGFP+神经纤维，这也表明DRG 神经元存在普遍感染（图3～4）。而脾、肠、肾和胰腺等内脏器官感染效率极低（图6～7）。

AAV 常被用作治疗中枢神经系统疾病的工具［35］。P0 小鼠腹腔注射可以特异性靶向DRG 或NG 相关的遗传病［17，36-37］。这种递送方法的基因治疗存在一个缺点，它不适合治疗慢性疼痛和慢性瘙痒，比如我们不可能给新生儿注射AAV 来预防他们长大后的疼痛或瘙痒。

综上，我们建立了一种无创的AAV 递送方法，该方法可以高效地特异性感染DRG 神经元和NG神经元，为专注于DRG 和NG 的科学家或研究周围神经系统与外周器官相互作用的科学家提供了一种新的系统药物递送方法。

作者贡献声明陈紫悦 冰冻切片，免疫组织化学，数据统计和分析，论文撰写。刘帅 电生理，行为学测试。杜婉洁 收集实验样本。童芳 P0小鼠腹腔注射。王芸芸，华领洋 论文修订。宫晔，韩清见 论文构思和修订，研究指导。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。