香蕉细菌性枯萎病菌可视化检测体系的建立与探索

张可煜

摘要 香蕉枯萎病对香蕉植株具有毁灭性危害，严重制约了世界各地香蕉种植业的发展。基于此，建立了香蕉细菌性枯萎病菌可视化检测体系，探究了检测体系最佳引物组合、引物浓度、Cas12a浓度，以及可检测到的最低样本浓度。试验证明，该体系可以在60 min内完成准确的检测，且所需仪器简便，对试验环境和操作人员没有特殊的专业要求，该鉴定方法在植物病原菌的分子定性检测中的潜力较大。

关键词 香蕉枯萎病菌；分子鉴定；可视化

中图分类号：S436.68 文献标识码：B 文章编号：2095–3305（2023）09–0037-03

由尖胞镰刀菌古巴专化型（Fusarium

oxysporum f. sp. cubense，简称Foc）引起的真菌性枯萎病（又称之为巴拿马病）会对香蕉造成巨大危害，被认为是“香蕉癌症”。作为一种维管束病害，香蕉枯萎病最直接的症状表现为叶片枯黄、维管束堵塞、腐烂发黑，维管束的堵塞会使得香蕉植株吸收不到营养，最终导致整株枯死[1]。香蕉枯萎病菌的致病力极强，该病害严重制约了我国香蕉产业的健康稳定发展。作为全国香蕉的主产地，广东省受香蕉枯萎病的危害极大[2-5]。

基于此，主要针对广东省的香蕉枯萎病热带4号生理小种菌株构建病菌检测体系。

CRISPR/Cas核糖核酸内切酶系统，如Cas12a、Cas13a和Cas14能够对病原样本进行快速、准确的检测。Cas12a 具有反式切割活性，可以通过crRNA引导识别目标序列5＇端以Poly-T为前间区序列邻近基序的特异片段（5＇-TTTN-3＇），对体系中的任意单链DNA探针进行无差别切割，从而实现对目标基因的检测。目前，有很多研究将Cas核糖核酸内切酶与序列扩增方法相结合，开发出SHERLOCK、HOLMES、DETE-CTOR、STOP、opv-CRISPR等高靈敏度和特异性的核酸检测平台，可用于致病病毒和微生物的检测[6]。但是，目前开发的技术仍需要昂贵的淬灭荧光报告器和设备。

基于CRISPR的核酸检测在病毒性疾病分子诊断中具有良好的前景，但其鲜有被用于植物病原菌的检测。将LAMP技术和CRISPR/Cas12a偶联，利用LAMP高特异性、灵敏度强、可在短时间内大量扩增基因序列的特点，以及CRISPR/Cas12a精准剪切、高灵敏度的特点构建出一个新型的香蕉枯萎病鉴定系统，为香蕉枯萎病的前期防治提供简便、高效的工具。

1 试验方法

1.1 香蕉枯萎病菌株

广东省采集的香蕉枯萎病菌株鉴定为热带4号生理小种，菌株命名为II5。非致病枯萎病菌株为Fo47。

1.2 试验引物设计

试验涉及的LAMP引物统一通过NEB® LAMP Primer Design Tool设计。合适的LAMP引物是有效扩增的关键，GC比值在40%～60%为宜，引物对的Tm值相近（不超过5 ℃），扩增产物的长度≤280 bp，二聚体ΔG≥-3.5，引物末端ΔG≤-4.0。设计好的引物通过枯萎病菌数据库进行比对，确保其可扩增片段的唯一性。

1.3 引物特异性分析

对设计好的LAMP和PCR引物序列进行BLAST比对，以评估引物的特异性。运用BLASTN将设计的引物序列比对到参考菌株II5的基因组，由于是引物比对，设置的Evalue值为1，并加入参数-task blastn-short。再根据比对结果，查看引物是否适合进行PCR扩增。

1.4 LAMP反应体系

整个LAMP恒温扩增体系体积为25 μL，其中，包括12.5 μL 1×LAMP混合液，2.5 μL Primer Mix （包括0.16 μ mol/LFIP和BIP，0.02 μ mol/L F3和B3，0.04 μ mol/L LF和LB，提前配置成1 μM的混合体系），1 μL 浓度为5 ng/μL的基因组DNA模板，9 μL无酶双蒸水。整个反应体系在恒温金属浴65 ℃条件下扩增45 min。

1.5 CRISPR/Cas12a介导的剪切体系

CRISPR/Cas12a介导的剪切反应体系体积共25 μL（2×），该混合体系包括美格生物Cas12a蛋白试剂盒（广州美格生物科技有限公司，Code No： C001）10×Buffer 12.5 μL，以及终浓度为20 n mol/L的Cas12a蛋白，终浓度为40 n mol/L的crRNA，终浓度为40 n mol/L的单链DNA探针。该反应在37 ℃的恒温金属浴中孵育15 min后，在蓝光仪下进行观察和拍摄。

2 结果与分析

2.1 LAMP引物和crRNA的筛选

经检索，FOIG_16668中共有3个Cas12a识别切割的PAM结构域，以此设计3个不同区域的crRNA。以香蕉枯萎病4号生理小种菌株II5基因组DNA为模板，通过LAMP扩增FOIG_16668序列，检测3条crRNA，得到16668crRNA③具有较好的敏感度和特异性（图1）。

利用LAMP扩增，使用16668crRNA③介导Cas12a切割试验，比较FOIG_16668的结果（图2）。其中，从左往右，①为II5阳性对照，②为Fo47阴性对照，③为空白对照。在FOIG_16668的6对引物中，a、b和c组出现了“假阳性”，e、f组经过Cas12a的剪切后并未出现特异性荧光，可能是crRNA剪切受到了位置限制。因此，D组引物的结果最准确、稳定。最终确定FOIG_16668的D组引物+16668crRNA③组合。

2.2 最适Cas12a酶浓度摸索

为探究Cas12a的浓度是否是LAMP-CRISPR检测的一个限制因素，对Cas12a进行了浓度梯度试验。从荧光亮度检测特异性来看，20～40 μ mol/L的Cas12a对检测结果的特异性和灵敏度并无差别，而10 n mol/L的Cas12a的检测亮度有所下降，但特异性与其他浓度无差别（图3）。为了保证检测结果的直观和灵敏度，最终选择20 n mol/L的Cas12a作为体系标准。

2.3 最适LAMP引物浓度摸索

为探究LAMP扩增体系中的引物浓度，将引物按梯度稀释为1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 μ mol/L。能扩增的最低引物浓度为0.1 μ mol/L，因此试验的LAMP体系中的引物浓度标准为0.1 μ mol/L（图4）。

2.4 LAMP-CRISPR/Cas12a体系的假阳性影响因素探究

2.4.1 引物的设计及选择 LAMP引物的设计是影响其结果准确性的关键因素。以FOIG_16668上的3组引物（A、C、D）为例，CRISPR和琼脂糖凝胶电泳的结果表明，A组和C组引物会出现非特异扩增，而D组引物的特异性和准确度最高（图5）。在引物设计网站上，A组引物的各条件参数最理想，但扩增结果并不特异。因此，LAMP引物的特异性并不能单纯依据参数判定，需要结合下游的检测手段进行检验。

2.4.2 CRISPR/Cas12a反应时间的影响 FOIG_16668的扩增产物经Cas12a切割后（反应条件为37 ℃，15 min），即使离开37 ℃恒温域，随时间推移仍会出现“假阳性”（图6）。通过间隔性观察发现，在CRISPR/Cas12a剪切反应的20 h后，Cas12a会开始出现非crRNA介导的剪切，只要反应体系中还存在ssDNA探针，就会被其切割并产生荧光。

3 讨论

被称作“香蕉癌症”的香蕉枯萎病是香蕉产业的巨大威胁，且尖孢镰刀菌古巴专化型作为土传真菌具有很强的传播力和危害性。从源头控制该病菌的传播是植物防疫的重点，植物病菌的预防检疫对香蕉枯萎病的控制起到至关重要的作用。香蕉枯萎病热带4号生理小种的危害性最大，几乎可侵染所有品种的香蕉，主要针对广东省香蕉枯萎病4号生理小种构建快速检测体系。

前人关于香蕉枯萎病分子鉴定的研究有许多，如DNA指纹图谱、常规PCR、多重PCR、real-time PCR、real-time LAMP等，但这些方法都需要专业的仪器操作和特定的试验环境[7-9]。目前，尚未有通过LAMP和CRISPR/Cas12a偶联的方法检测香蕉枯萎病菌的相关报道。

LAMP具备丰富的下游检测方式，如SYBR Green I、HNB、Calcein等，但这些方法都存在一定的不足。例如：焦磷酸鎂浊度检测的结果很难通过肉眼观察得到，需通过实时浊度分析仪进行；采用荧光染料（比色法）对LAMP扩增结果进行下游检测的报道很多，且大多数研究是基于病原菌的检测，如HNB羟基萘酚蓝、SYBR Green I等。但是荧光染料受环境影响大、不灵敏、本底颜色深，会对结果的判定造成干扰。试验采用的CRISPR/Cas12a通过识别特异序列，利用自身反式切割活性对ssDNA探针进行切割，结果更适合用于裸眼观察，且通过crRNA靶向目标特异片段具有更高的灵敏度和准确度，可以达到识别单碱基突变（SNP）的水平。

但是LAMP-CRISPR/Cas12a也存在不足，如其LAMP引物和crRNA的组合需要通过大量试验验证和筛选。LAMP的初始扩增产物为双茎环结构，以此为基础才能形成多个环状链结构的双链扩增子。其中，F2c-F1和B2-B1c区域为环状双链，F1c-B1区域为线性化双链，虽然crRNA可以结合与线性化链相似的环状双链，但只有设计在F2c和B2位置之间的crRNA才可以实现更高的切割效率。因此，有相关研究表明，crRNA的结合位点决定了其Cas12a切割效率和准确性，可以通过改变PAM的位置提高Cas12a的切割效率，从而降低出现假阳性的概率，增强准确性。

参考文献

[1] 张俊芳，李铮，李晓慧.香蕉抗枯萎病研究现状及展望[J].热带农业科学，2015， 35（12）：108-112.

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Establishment and Exploration of A Visual Detection System for Banana Bacterial Wilt Pathogen

Zhang Ke-yu （College of Horticulture， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642）

Abstract Banana wilt disease poses a devastating threat to banana plants， severely constraining the development of banana cultivation worldwide. Based on this， a visual detection system for banana bacterial wilt pathogen was established， exploring the optimal primer combination， primer concentration， Cas12a concentration， and the lowest detectable sample concentration of the detection system. The experiment has proven that the system can complete accurate detection within 60 minutes， and the required instruments are simple， without special professional requirements for the experimental environment and operators. This identification method has great potential in molecular qualitative detection of plant pathogens.

Key words Banana wilt pathogen; Molecular identification; Visualization