啮齿类动物实验性经前烦躁症模型研究进展

许佳玲,刘 坤,邢 影,胡明会,张 浩,李自发,耿希文*,魏 盛*

(1.山东中医药大学中医药创新研究院,济南 250355;2.山东中医药大学中医学院,济南 250355;3.山东中医药大学实验中心,济南 250355)

Hantsoo 等[1]在2015 年的一项研究经前烦躁症(premenstrual dysphoric disorder, PMDD)与工作表现联系的结果表明,PMDD 患者普遍伴随较差的工作-生活平衡、较低水平的心理承受能力和较低工作效率等情况。而随着病情加重,患者会表现出工作能力差、有效工作时间下降等,病情严重的甚至会无法工作。此外,PMDD 患者还多伴随大量饮酒、睡眠质量差以及情绪焦虑、抑郁等症状,这表明了PMDD 对女性的工作与生活造成了重大影响。目前PMDD 发病机制的研究主要集中在如孕酮(progestrone, P)[2-5]及其代谢产物四氢孕酮(allopregnanolone,ALLO)[6-8]调控的激素分泌以及γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)[9-12]等受体表达量改变方面,但目前其病理机制尚未明确。动物模型是研究PMDD 病机的重要载体,因此构建能够准确模拟临床病理症状的动物模型十分关键。为此本文将对目前PMDD 的病理机制研究及啮齿动物的造模方法等内容进行梳理,总结现有动物模型对于PMDD 的研究的贡献及局限性,以期为相关研究人员提供较为全面的建模参考及更精准的动物模型选择方案,为推进PMDD 的病理机制研究及治疗方案研发提供更多可能性。

1 PMDD 疾病定义和诊断标准

PMDD 被第五版国际精神障碍诊断与统计手册(the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorder,Fifth edition ed.DSM-5)认定为抑郁症的五种类型之一[12],是一种涉及多种身体及情绪症状的严重经前综合征亚型。据文献报道,80%的女性在育龄期间会出现轻微的经前期综合征症状,其中出现中度到重度症状的比例高达1/4,最严重的症状即PMDD,患者占比为3%~8%[13-14]。PMDD 患者会周期性出现多种躯体及精神症状,这不仅危及患者的身体健康,还会严重影响其日常生活和人际关系。

DSM-5 的诊断标准中认定:必须连续两个月经周期出现11 个相关症状中的5 个症状才能被诊断为PMDD(相关症状见表1),并且4 个严重症状(抑郁、焦虑/紧张、易怒/愤怒、情绪不稳定)必须出现一种[14-15]。PMDD 的这些症状并不会因为患有其他精神疾病而加重,因为PMDD 的一些症状(如4个严重症状)具有月经周期性,只在黄体期出现,并在月经结束后的1 周内会消失。这种月经周期性也是诊断PMDD 的必要条件[13]。

表1 PMDD 的诊断标准Table 1 Diagnostic criteria of PMDD

2 PMDD 的发病机制

PMDD 的病因复杂,众多内部和外部因素如:激素变化、遗传、营养不良、饮食偏好、环境改变、早期的社会生活环境、神经递质和免疫系统的改变等[15-16]都能导致症状出现。其中研究最多的是下丘脑-垂体-卵巢(hypothalamus-pituitary ovarian,HPO)轴和下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamuspituitary adrenal,HPA)轴相关的激素分泌,其他的研究对象还包括 GABA 能系统、 5 - 羟色胺(serotonin, 5-HT)系统及基因多态性等,都被认为与PMDD 的病理机制相关。

2.1 PMDD 与激素分泌

目前研究人员对PMDD 研究最为广泛的是与其症状一同周期性出现及消失的卵巢激素波动。孕酮被报道为PMDD“严重程度每日报告(daily record severity problems, DRSP)”的预测因子,二者可能有较强的相关性[17]。另有研究表明情绪改善(低程度的攻击性、易怒和疲劳)与高孕酮水平正相关[18]。孕酮的快速下降会诱发PMDD 易感患者出现症状,而其缓慢下降则可以避免症状出现[2-4]。

孕酮及其代谢产物ALLO 会随着月经周期发生自然的波动,其浓度从卵泡期到黄体期不断增加,而在黄体中晚期,血清中ALLO 与孕酮的比例较低。有研究报道称有抑郁症病史的PMDD 患者这个比例与正常女性不同[6-7]。这个可能说明,先前的条件应激可能会以某种特定酶为靶点,影响PMDD 患者体内孕酮转化为其代谢物。同样的,另一项研究也认同这个观点:在月经周期中阻断孕酮转化成ALLO,即黄体期ALLO 减少,将会引起焦虑、易怒和悲伤情绪症状[8]。因此研究者认为月经周期中ALLO 下降可能是5α 还原酶的表达量的变化导致,从而诱发PMDD 症状。

此外,通过对比PMDD 患者与健康女性的基础状态,研究人员发现PMDD 患者体内ALLO 和孕酮相较呈高水平,且该患者对皮质醇的敏感性低,并在应激状态下PMDD 患者体内ALLO 水平没有波动[19-20],这表明她们体内HPA 轴负反馈功能失调[19]。另一项研究也表明,PMDD 患者经历长时间应激会出现HPA 轴反应减弱现象[21-22]。而在PMDD 患者中经历过身体、情感或性虐待的比例显著高于对照组女性[23-24],这些女性表现严重精神症状的同时也同样存在应激状态下HPA 轴反应迟钝的现象。这些研究结果都表明,患者早年应激导致HPA 轴的损伤可能与PMDD 出现相关。

2.2 PMDD 与GABAA 受体表达

GABAA受体是一个由两个α、两个β 和一个γ或δ 亚基组成,中心为Cl-渗透通道的五聚体复合物[9,25-26]。GABAA受体上有两个不同的ALLO 和其他神经活性类固醇的识别位点[23],所以GABAA受体对压力和激素环境很敏感[25-26]。大脑中α/β/δ三种亚型组合而成的 GABAA受体对ALLO 及神经类固醇具有高度敏感[26]。有报道称,人为诱导动情周期的动物模型,运用孕酮撤退模拟黄体期孕酮快速下降会导致海马(hippocampus, Hip)[10]和杏仁核(amygdala, Amy)脑区[11-12]中GABA 门控总电流的减少和GABAA受体α4 亚基增加[10]。

因GABAA受体对压力环境敏感,所以长期处于应激状态会使GABAA受体特定亚基的表达发生变化。例如,在强迫游泳(forced swimming test,FST)、慢性轻度压力、长期社会压力或社交隔离情况下,雄性小鼠前额叶皮质(prefrontal cortex,PFC)和Hip 中,α4、α5、δ 亚基的表达量明显上升,而α1、α2、γ2 的表达则显著降低[27]。这些亚基表达量的改变会导致GABAA受体对神经活性类固醇的敏感性发生变化。所以经历长期压力可能导致GABAA受体亚基组成的改变从而参与了PMDD 患者焦虑和抑郁表型的产生。另外来自动物模型的一致证据表明,脱氧皮质酮(deoxycorticosterone)、脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone)、孕酮的3α-、5α-和5β-的还原代谢物是GABA 受体的正向调节因子[28]。这些化合物在应激时通过激活Hip、Amy 和PFC 及其他脑区中的GABAA受体从而抑制HPA 轴的激活[29-30]。

2.3 PMDD 其他发病机制研究

标记的PMDD 遗传候选基因包括5-HT 转运体(serotonin transporter, 5HTTLPR)和脑源性神经因子(brain-derived nerve factor,BDNF)66 位基因序列上缬氨酸突变为蛋氨酸(valine66 Methionine,Val66 Met)的多态性基因[31]。选择性5-HT 再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs)的快速给药可以减少Wistar 雌鼠动情周期依赖性埋珠行为和攻击行为[32],这表明5-HT 系统或许参与这些行为之中。

而BDNF Val66 Met 的PMDD 患者对比携带蛋氨酸(methionine,Met)等位基因的对照组,携带Val66 Met 基因患者在月经黄体期表现出额扣带回皮质较低程度的激活[31]。有报道表明一种与PMDD 特异性相关的神经过敏症的患者血清中BDNF 含量下降[32],这说明PMDD 可能与BDNF Met 等位基因突变相关。

3 动物模型

以转化医学为重点,从动物研究返回到人类临床研究必须加强基础研究和临床研究之间的联系,研究者必须综合考虑动物模型的效度标准,而效度标准包含内部和外部效度。简单来说,内部效度包括实验的可重复性、观察者的可靠性、实验的随机性以及设计中的质控。而外部效度则涉及到样本研究的适用性,以确保建立类似病理学动物模型[33]。主要外部效度标准包括:同源效度、病理效度、机制效度、表面效度和预测效度等[34-35],因此,在建立实际动物模型时,应综合考虑众多因素,尽可能达到多项效度标准从而制备可靠的实验动物模型。

造模效度标准是判定动物模型是否达到实验研究标准的指征。如因动情周期性激素波动,动情间期晚(late diestrus,D2/LD)期孕酮的快速下降会导致模型动物出现如焦虑、攻击和抑郁样行为。同时,药物干预使得模型动物体内两种激素(P/E2)的水平都达到相应内分泌标准,能有效预防或改善病理行为特征,这说明造模方法达到了表面效度。氟西汀作为抗抑郁药在临床试验中有效地改善了PMDD 症状,也有效改善动物模型的内分泌及行为特征,达成了预测效度标准。而基于孕酮或ALLO含量变化在PMDD 疾病中的内分泌病机,在LD 时期或因孕酮停用显示一定程度病理表型的动物模型,显示达成病理效度。另外,有研究表明使用居住入侵者测试(resident-intruder test,RIT)等方法造就的易怒/攻击性(焦虑样行为指标之一)和抑郁样表型的动物模型出现GABAA受体亚基组成的改变[9],这在某种程度上可能达到了机制效度。

3.1 造模动物的动情周期

从PMDD 患者的临床症状可以得出动物模型的核心表型,如月经周期的黄体期呈现焦虑、抑郁以及攻击性/易怒增加,或在一段时间的激素抑制后,可以在动物模型中观察到表1 中的症状。由于PMDD 复杂的发病机制以及其表型在特定生理周期出现及消失,为了验证PMDD 动物模型的表面效度,构建动物模型时明确动情周期尤其重要。

月经周期的计算以本次月经的第一天开始到在下一次月经来潮前1 d 计算,人类女性平均月经周期为29.3 d[36]。除妊娠期外,女性的月经周期从月经初潮开始会持续到更年期绝经结束[14]。女性月经周期分为两个阶段:(1)卵泡期:从月经结束日开始至排卵日结束。该时期特点是孕酮水平低且持续不变,E2水平在接近轻度卵泡期持续增加,在排卵日水平达到最高。(2)黄体期:从排卵后1 d 开始,在月经来潮前1 d 结束。在这个阶段,E2最初下降,但几天后,它略有增加,在月经前再次下降[14]。相比之下,孕酮在黄体初期开始上升,在黄体期中期达到峰值,并在后期快速下降。正是此时PMDD症状出现。

啮齿类动物的卵巢周期(也称为动情周期)是生殖和内分泌系统的一系列组织学和生理周期性变化的循环时长,根据其激素波动水平判定,一般约为4~5 d[14]。以大鼠为例,其动情周期可大致分为1~2 d 的接受期(receptive phase,R 期)和约3 d的非接受期(nonreceptive phase,NR 期)。R 期包括动情前期(proestrus,P 期)和动情期(estrus,E 期);NR 期包括动情间期早期(metestrus,D1/M 期)和LD 期。啮齿动物的R 期和NR 期分别对应人类女性月经周期的卵泡期和黄体期(经前期)。

3.2 造模方法

过去关于PMDD 的神经生物学研究都证实了其病理复杂性。在基础研究中,既可以通过给予动物一些应激条件以重现PMDD 主要症状,进而对啮齿类动物进行类似抑郁、易怒、攻击性和焦虑症状的行为特征分析,也可以通过激素操纵的方式获得稳定动情周期的实验动物进而研究其特定的受体表达量及功能的变化。因此目前PMDD 动物模型的动情周期分为自然动情周期与人工诱导的动情周期。以下根据实验动物具备的动情周期类型分别进行造模方法介绍。

3.2.1 自然动情周期实验动物的造模方法

(1)情绪刺激(emotional stimulation,ES)

ES 造模主要依赖于情绪干扰,通常包含多种外部因素。苏云祥[37]将大鼠连续5 d 置于可调噪声和脉冲电刺激的笼内进行造模,每日进行阴道涂片检测大鼠的动情周期,并进行行为学及生物学检测,结果发现模型大鼠在LD 时期出现PMDD 症状,且下丘脑(hypothalamus,HT)和PFC 中去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)含量增加,Hip、HT 中多巴胺含量增加,Hip、HT 和外周血血清中5-HT 含量降低。这说明这种造模方法是通过引起模型动物激素变化而诱导出PMDD 症状,符合上述机制效度和表面效度标准,表明该造模方法可造就PMDD 病理模型亚型。

(2)慢性束缚应激(chronic restraint stress,CRS)

CRS 是一种常见的诱导抑郁模型的应激方法,它具有可操作性及可重复性,并能完整地模拟快感缺失状态。侯金良[38]通过观察大鼠阴道涂片细胞形态监测大鼠动情周期,并连续4 个NR 期对大鼠CRS 处理进行PMDD 造模后续使用氟西汀胶囊进行治疗,并在用药前后进行旷场、高架十字迷宫和FST 等行为学测试及NE、5-HT 等生物学检指标测,这种造模方法使大鼠在LD 时期出现PMDD 类似症状,行为学及生物学结果一致证实CRS 造模法达到表面效度、机制效度以及预测效度。

(3)大理石球埋藏(marble burying,MB)

Schneider 等[39]依据大鼠对明亮物体规避惊惧的生理特点,对雌性大鼠进行适应性饲养,结束后每只大鼠单笼进行造模,首先向其所在的鼠笼投放9(3×3)个直径为2.3 cm 的明亮大理石球,再给予红光及噪声应激10 min,诱导其产生埋藏行为后给予不同类别的抗抑郁药(氟西汀、地西帕明、诺米芬辛)及地西泮和孕酮治疗。结果显示该造模方法可以在动物中模拟PMDD 样症状,并且药物治疗可以减少发情周期依赖的大理石掩埋行为。这表明MB造模法可以达成表面效度、病理效度及预测效度。该造模方法配合电刺激衍生的电击探针埋藏测试(shock-probe burying test)[40]同样是一项广泛用于焦虑样精神疾病的造模方法。

(4)强迫游泳(FST)

FST 会导致老鼠感到“行为绝望”,从而诱发类似抑郁的情绪。强迫游泳测试后对比NR 期和R 期的差值进行PMDD 模型的选取。通过比较动情周期中NR 期(类似于黄体期)和R 期(类似于卵泡期)的静止时间和静止次数,并选择NR 期明显高于R 期的大鼠(类似于经前期的抑郁状态和经后期的抑郁样情绪的改善)作为PMDD 模型[41]。目前已有多项研究表明对自然动情周期的大鼠进行3 次FST,可以诱导大鼠出现PMDD 样症状[42-44],并且生物学检测结果显示,造模大鼠出现ALLO[42]、GABA受体亚基[42]及特定脑区蛋白[43-44]等表达量改变。我们之前的研究结果也发现FST 会导致大鼠在动情周期的NR 期抑郁样行为加剧,而该症状会在R期缓解[45]。这一系列表面效度、病理效度及机制效度都说明FST 是一项有效的PMDD 造模方法。

(5)居住入侵(RIT)

为了寻找一种PMDD 的自然动物模型,研究者常选择给予实验动物一些社交应激,后分析其在不同动情周期阶段中的攻击性行为筛选出模型动物。RIT 是一种重要的社交应激类型,这种造模方法是将大鼠单笼饲养进行社交隔离,这样大鼠会对居住地产生一种天然的领地占有感,当有外来大鼠进入笼子时,它会出现本能的攻击行为[46],大鼠这种由本能攻击性诱发的愤怒情绪可以模拟人类焦虑、抑郁、攻击性等精神障碍症状,其优势在于可以减少因人为干预造成的大鼠伤害[47]。并且研究发现使用该方法造就的PMDD 大鼠在NR 期出现PMDD样症状,并且与对照组相比其血清中孕酮、ALLO 及GABA 含量下降[48]。这说明这种造模方法具备表面效度及病理效度。

3.2.2 人工诱导动情周期实验动物的造模方法

人工诱导PMDD 模型的手段主要是对实验动物进行卵巢摘除后,人为定期给予激素注射使其模拟PMDD 患者月经周期性激素变化,从而诱发动物在LD 时期出现PMDD 样症状。人为激素诱导可以精准地操控动物的动情周期,从而实现快速有效地动情周期监控进行病理研究。

(1) 孕酮撤退(progesterone withdrawal,PW)模型

PMDD 症状开始于黄体后期,并在月经结束不久后消失,大鼠体内孕酮含量会在黄体萎缩后下降,该过程称为PW。PW 会导致子宫内膜收缩,黄体细胞凋亡和解体,导致子宫内膜出血、脱落以及月经的发生。由于PMDD 症状在围经期出现及结束,最初有人提出性腺激素(P 和E2)参与其病理生理过程[17],血清中孕酮水平在黄体末期快速下降[2-4],而研究证明情绪症状与这种快速的PW 相关,利用促性腺激素抑制排卵及孕酮波动可以防止一些PMDD 负面情绪的发生[49]。研究人员发现给予大鼠长期人工注射孕酮突然停止注射后,也会表现出典型的焦虑样行为[10]。同样的结果在Wang[50]的研究结果也被发现:他们对大鼠连续4~5 d 孕酮注射,并在最后一次孕酮注射24 h 后进行防御性埋珠行为测试,结果大鼠表现出焦虑样行为增加。这样的结果在植入孕酮缓释栓剂移除后也被观察到。相反,孕酮的缓慢减少并没有诱发类似的焦虑样行为[51]。随后,不同的研究人员通过埋珠测试[52]及其他如明暗穿梭箱[51,53]和高架十字迷宫[52,54]、旷场实验[53]等焦虑行为测试都报道了PW的致焦虑作用。此外,研究人员还使用PW 模型进行FST、社交偏好测试和糖水偏好测试来研究抑郁样行为[55-56]。结果一致表明这种激素操纵能诱发相似的焦虑、抑郁样行为,这表明PW 造模可以达成病理效度、机制效度及表面效度。

(2) 四氢孕酮(3α,5α-tetrahydroprogesterone,THP)撤退模型

消炎痛(吲哚美辛)是一种3α-羟基类固醇氧化还原酶阻滞剂,具有防止孕酮转化为ALLO 的作用。Li 等[57]发现服用消炎痛可以预防孕酮撤退引起的焦虑特性。同样的,由于GABAA受体δ 亚基对THP 的调控具有高度敏感性,Smith 等[58]设计了一个敲除GABAA受体δ 亚基的小鼠模型,建立了THP 的小鼠模型,经高架十字迷宫测试发现THP 对野生型雌性小鼠有致焦虑作用,且小鼠海马体 1(CA1)区中GABAA受体α4 亚基的表达增加,但δ亚基敲除鼠并未产生焦虑样表型。这说明ALLO 可通过调节GABAA受体产生焦虑样行为表型。这种表面效度和机制效度表明,THP 撤退可能是PMDD动物造模的方法之一。

不同造模方法对拥有自然及人工诱导稳定动情周期的动物造模诱导效度不同,模型侧重也不尽相同,不同模型具有不同的优劣势(具体见表2)。但这也为PMDD 疾病研究提供了更多的可能性,特别是中医“辨证论治”治则中针对PMDD 的不同病证进行对症治疗提供了思路。

4 总结与展望

PMDD 作为一种严重的围经期情绪障碍疾病,对于女性患者的生活、工作及人际交往等多方面造成了巨大的影响。目前对于该疾病的深层病理机制并不完全清楚,借助动物模型可以更好地帮助我们临床转化以研究其病理机制。虽然目前尚未开发出一种能完整模拟人类PMDD 女性患者表型、达到完整造模效度的动物模型,但已有许多研究证实动物模型有助于研究PMDD 在内的精神疾病。所以研究者研究中有必要综合考虑其复杂病因及不同亚型从而选用最合适的造模方法,同时根据基础及临床研究结果,进行不断完善从而建立更能模拟人类女性PMDD 病症的动物模型。我们之前的研究内容中关于PMDD 的造模方法在RIT[59]和FST[45]范式做了改良与优化,能更好地模拟啮齿类动物动情周期依赖性的疾病特征,这可能为PMDD研究动物造模提供一些参考。

PMDD 的病因涉及众多内部和外部因素,并且目前研究表明其神经生物学机制错综复杂。梳理相关文献证据,我们认为女性PMDD 发病的直接原因是生理时期性甾体激素及其代谢产物波动,继而影响相应受体的敏感性及表达量发生改变,导致中枢神经系统内该类受体的作用递质如 GABA 、5-HT等神经递质的异常,引发多脑区以及相关神经环路的功能紊乱最终导致相应精神行为症状。在我们之前的研究中也证实了在PMDD 大鼠模型中GABAA受体的α4 亚基表达量明显增多[45]。因此,后续关于PMDD 机制探索工作中,可以更多关注特定生理时期因性甾体激素、代谢产物发生波动变化引发的受体及神经递质的功能改变,以及分析HPA轴激素的改变是如何诱导GABAA受体亚基组成、GABA 能和谷氨酸能系统及5-HT 能系统功能发生改变,另外深入探究分子信号通路或特定脑区神经元活性改变也能为阐释 PMDD 深层病理机制以及开发新的治疗方法提供更广的思路。

此外,GABAA受体对于ALLO 等神经类固醇的高敏感性以及其特殊的药理性质,说明了GABAA受体与PMDD 病理机制可能密切相关,未来使用特定GABA 亚基(如α4、δ 亚基等)转基因敲除鼠进行造模及实验研究或许对病理机制阐明有重要帮助。另外,猕猴等非人灵长类动物与人类同属灵长类动物,其基因与人类有高度相似,有较为一致的遗传学特性,并且其身体结构与人类相似,面部皮肤裸露,易于观察其面部表情变化。这些特征在PMDD表型中观察情绪反应及疼痛部位方面占巨大优势,或许未来应PMDD 疾病深入研究的需求,灵长类动物模型会是新的研究发展对象。未来继续拓展动物病理模型及优化造模方法对于病理研究是必要的,相信未来我们能够找到研究PMDD 更好的方案,为PMDD 的针对性治疗和药物的开发带来希望。